健脾解毒化濁方治療腸易激綜合征的基礎(chǔ)及臨床研究.pdf

1、目的：腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種因腸道高敏感性所致的腸道應(yīng)激性疾病，是指一組包括腹痛、腹脹、腹瀉，病因和發(fā)病機(jī)制迄今尚未闡明的功能性腸紊亂癥候群。隨著生活節(jié)奏的不斷加快和社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)的日趨激烈，國內(nèi)外發(fā)病率在不斷上升，嚴(yán)重影響了人們正常的工作、學(xué)習(xí)和生活。 IBS的病因和發(fā)病機(jī)制迄今尚未闡明。目前認(rèn)為內(nèi)臟敏感性增高是IBS最重要的病理生理特征之一，是IBS病人癥狀產(chǎn)生的基礎(chǔ)和癥狀多

2、樣化的原因。近年來研究提示，肥大細(xì)胞在腸道應(yīng)激性疾病發(fā)生的病理生理過程中起關(guān)鍵作用，肥大細(xì)胞被活化后，可釋放許多生物活性不同的介質(zhì)，介質(zhì)釋放可進(jìn)一步放大各種生理病理反應(yīng)，從而導(dǎo)致各種癥狀的發(fā)生。所以，通過抑制腸道肥大細(xì)胞活化，使其減少釋放組胺、P物質(zhì)等介質(zhì)的數(shù)量，是治療腸道應(yīng)激性疾病的關(guān)鍵所在。 IBS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及精神、飲食、個(gè)體素質(zhì)多個(gè)方面，單一藥物臨床作用局限，不能滿足臨床要求。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)亦認(rèn)為，腹痛泄瀉成因復(fù)雜，治

3、法也多。健脾解毒化濁方是著名中醫(yī)專家李佃貴教授經(jīng)多年臨床實(shí)踐總結(jié)出來的經(jīng)方，由白頭翁、黃連、黃芩、人參、黃芪、白術(shù)、白芍、陳皮、防風(fēng)、秦皮、苦參、地榆、木香、薏米、當(dāng)歸、甘草等組成，具有解毒化濁、舒肝健脾、清熱燥濕之功效，健脾解毒化濁方經(jīng)過長期的臨床觀察，對(duì) IBS 有較好的療效。 為了進(jìn)一步探討健脾解毒化濁方治療IBS的藥理作用及其機(jī)理，本研究從藥理學(xué)研究出發(fā)，以肥大細(xì)胞功能研究為重點(diǎn)，應(yīng)用血液生化學(xué)、藥物血清學(xué)、免疫組織化學(xué)

4、、體外細(xì)胞培養(yǎng)，以及分子生物學(xué)方法，分別通過對(duì)內(nèi)臟高敏感性IBS大鼠模型行為學(xué)和電生理指標(biāo)、血生化的監(jiān)測(cè)，對(duì)大鼠腹腔肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象的觀察，以及對(duì)大鼠腹腔肥大細(xì)胞表面抗體的研究，試圖從器官水平、細(xì)胞水平和基因水平三個(gè)方面來探討健脾解毒化濁方對(duì)IBS的療效和作用機(jī)理，并結(jié)合健脾解毒化濁方在臨床上的實(shí)際應(yīng)用療效研究，為發(fā)揮中藥名方多途徑、多靶點(diǎn)及整體治療的優(yōu)勢(shì)，科學(xué)開發(fā)利用中藥名方提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為新藥的開發(fā)打下基礎(chǔ)。 方法

5、 第一部分健脾解毒化濁方對(duì)內(nèi)臟高敏性腸易激綜合征大鼠模型的療效和作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)一：采用結(jié)腸醋酸慢性刺激法制作內(nèi)臟高敏感性的IBS大鼠模型。造模分為幼年大鼠結(jié)腸醋酸慢性刺激組(NA 組)、成年大鼠結(jié)腸醋酸慢性刺激組(AA組)和空白對(duì)照組(NS組)。造模后對(duì)各組IBS大鼠模型分別進(jìn)行內(nèi)臟敏感性評(píng)估(腹壁肌電活動(dòng)和腹部回縮反射)，以驗(yàn)證造模是否成功。 實(shí)驗(yàn)二：探討健脾解毒化濁方對(duì)內(nèi)臟高敏感性IBS大鼠模型的療效和

6、作用機(jī)理。造模成功后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為空白對(duì)照組(A組)、模型對(duì)照組(B組)、得舒特組(C組)、健脾解毒化濁方低劑量組(D組)、健脾解毒化濁方高劑量組(E組)。觀察各組大鼠在不同因素影響下的腸道內(nèi)擴(kuò)張引起腹部抬起和背部拱起的容量閾值和大鼠腸道內(nèi)不同容量下擴(kuò)張期間腹壁收縮次數(shù)，檢測(cè)5-羥色胺(5-HT)、P物質(zhì)(SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)含量。 第二部分健脾解毒化濁方藥物血清對(duì)大鼠腹腔肥大細(xì)胞受抗原活化時(shí)脫顆粒的影響

7、 制備大鼠腹腔肥大細(xì)胞懸液，并進(jìn)行鑒定。同時(shí)制備健脾解毒化濁方藥物血清、西藥治療組藥物血清及對(duì)照組空白血清。實(shí)驗(yàn)分為健脾解毒化濁方藥物血清高低兩個(gè)劑量組為中藥治療組，色甘酸鈉組為西藥治療組，加空白血清及C48/80的作為陽性對(duì)照組，只加空白血清的作為空白對(duì)照組。分別觀察各組藥物血清對(duì)大鼠腹腔肥大細(xì)胞活化脫顆粒釋放組胺及TNF-α的影響；各組藥物血清對(duì)大鼠腹腔肥大細(xì)胞活化脫顆粒時(shí)細(xì)胞形態(tài)的影響；應(yīng)用鈣離子熒光指示劑Fluo-3，通過電鏡

8、和激光共聚焦熒光顯微鏡，觀察健脾解毒化濁方對(duì)大鼠腹腔肥大細(xì)胞受抗原活化時(shí)脫顆粒百分?jǐn)?shù)及肥大細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度和組胺釋放的影響。 第三部分健脾解毒化濁方含藥血清抑制大鼠腹腔肥大細(xì)胞脫顆粒的分子生物學(xué)機(jī)制 制備大鼠腹腔肥大細(xì)胞懸液，并進(jìn)行鑒定。同時(shí)制備健脾解毒化濁方藥物血清及對(duì)照組空白血清。實(shí)驗(yàn)分為高劑量健脾解毒化濁方藥物血清組、低劑量健脾解毒化濁方藥物血清組和空白對(duì)照組。應(yīng)用RT-PCR方法和免疫組織化學(xué)顯色方法分別檢測(cè)各組

9、大鼠腹腔肥大細(xì)胞的TLR2和Fas的表達(dá)。 第四部分健脾解毒化濁方治療腹瀉型腸易激綜合征的臨床研究 采用前瞻性隨機(jī)雙盲、西藥治療平行對(duì)照研究方法。對(duì)參與的研究者進(jìn)行診斷、納入排除標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)施方案的培訓(xùn)。從2004年12月至2006年12月共有137例腹瀉型IBS患者進(jìn)入研究，以1：1比例按隨機(jī)數(shù)字進(jìn)入中藥治療組和西藥治療組。中藥治療組口服健脾解毒化濁方，西藥治療組口服得舒特片。觀察項(xiàng)目包括治療前后的腹痛和大便情況，其它需觀

10、察的癥狀尚有排便急迫或脹墜感、胸脅或小腹脹悶、情緒緊張或抑郁惱怒時(shí)瀉泄加重情況、黏液便、噯氣以及進(jìn)食量等；體征檢測(cè)包括結(jié)腸區(qū)壓痛及舌脈象。治療前及治療3周停藥后行血、尿常規(guī)，肝腎功能和心電圖等檢查。密切觀察不良事件與不良反應(yīng)，記錄其發(fā)生的時(shí)間、表現(xiàn)、處理經(jīng)過及結(jié)果，注意有無嚴(yán)重不良事件與不良反應(yīng)發(fā)生。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)一：在造模第6周，NS組8只大鼠引起腹部抬高和背部拱起的擴(kuò)張容量閾值分別為(0.70±0.10)ml和(0.9

11、4±0.16)ml，AA 組大鼠上述兩項(xiàng)閾值分別為(0.76±0.06)ml和(1.02±0.88)ml，二者差異無顯著性(P>0.05)。而NA組大鼠腹部抬高和背部拱起閾值分別為(0.43±0.06)ml和(0.61±0.08)ml，與前兩組相比差異有顯著性(P值均<0.01)；在0.5ml容量時(shí)，NS組和AA組大鼠的腹壁收縮并不明顯，而NA組大鼠腹壁收縮數(shù)目達(dá)(6.63±1.06)次/5min，差異有顯著性(P<0.01)。在0.8

12、ml擴(kuò)張容量下，NA組大鼠腹壁收縮活動(dòng)均較另外兩組更為顯著(P<0.05)。在1.2ml擴(kuò)張容量下，NA組大鼠較NS組大鼠腹壁收縮顯著增強(qiáng)(P<0.05)，而與AA組差異無顯著性(P>0.05)。 實(shí)驗(yàn)二：在行為測(cè)試方面，用藥后，B組與A組相比，引起大鼠腹部抬起和背部拱起的擴(kuò)張容量閾值明顯降低，差異顯著(P<0.01，P<0.05)，而C、D、E組與A組相比，均無顯著差異(P>0.05)；D、E組與C組相比，均無顯著差異(P>0

13、.05)；腹壁肌電活動(dòng)記錄結(jié)果顯示，用藥后，B組與A組相比，在1.0ml、1.5ml擴(kuò)張容量時(shí)，大鼠腹壁肌肉收縮次數(shù)明顯增加，差異非常顯著(P<0.01)，而C、D、E組與A組相比，二者無顯著差異(P>0.05)，D、E組與C組相比，均無顯著差異(P>0.05)；與模型對(duì)照組相比，各治療組大鼠行為學(xué)和電生理指標(biāo)均有明顯改善；各治療組模型大鼠5-HT、SP含量明顯下降，CGRP 含量增加，且有一定的量效關(guān)系。 結(jié)論 1.

14、采用醋酸結(jié)腸慢性刺激法可造成穩(wěn)定的腸道高敏感性IBS大鼠模型； 2．健脾解毒化濁方能降低IBS模型大鼠血清5-HT、血漿SP含量，增加CGRP含量，大劑量健脾解毒化濁方療效優(yōu)于得舒特。 3．健脾解毒化濁方的作用機(jī)制可能是通過降低模型大鼠血清5-HT、血漿SP含量，減弱背角神經(jīng)元興奮性，提高內(nèi)臟痛閾，消除腸道過敏，從而達(dá)到治療目的。 4．健脾解毒化濁方是通過抑制肥大細(xì)胞Ca<'2+>的內(nèi)流，從而避免了肥大細(xì)胞的活化

15、，繼而抑制了肥大細(xì)胞的脫顆粒作用，減少肥大細(xì)胞內(nèi)組胺等介質(zhì)的釋放，以降低血清中組胺等介質(zhì)含量，減弱背角神經(jīng)元興奮性，從而提高內(nèi)臟痛閾，消除腸道過敏癥狀。 5．健脾解毒化濁方抑制大鼠腹腔肥大細(xì)胞脫顆粒的分子生物學(xué)機(jī)制可能是通過促進(jìn)大鼠腹腔肥大細(xì)胞膜表面TLR2與 TSP-2 結(jié)合，并通過Fas途徑，促進(jìn)大鼠肥大腹腔細(xì)胞表面過表達(dá)Fas，使其與抗大鼠Fas多克隆抗體相結(jié)合，從而促進(jìn)和直接誘導(dǎo)大鼠腹腔肥大細(xì)胞凋亡。 6．解毒化