急性百草枯中毒致肺損傷肺纖維化機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:1.探討百草枯中毒的作用機(jī)制。2.觀察細(xì)胞因子在百草枯中毒所致的急性反應(yīng)過(guò)程中所表現(xiàn)出變化規(guī)律。3.通過(guò)對(duì)(2)的實(shí)驗(yàn)觀察的結(jié)果，繼續(xù)追蹤細(xì)胞因子TGF-βmRNA的規(guī)律，探討百草枯中毒分子水平的機(jī)制。4.通過(guò)實(shí)驗(yàn)病理觀察百草枯中毒肺纖維化變化的規(guī)律。 方法: 1.百草枯中毒動(dòng)物模型的制備：健康Wistar大鼠24只，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、染毒3天組、7天組和21天組，染毒組按60mg/kg劑

2、量比配置百草枯懸液染毒，染毒組給予相應(yīng)劑量的百草枯溶液1ml灌胃，對(duì)照組同時(shí)給予1ml蒸餾水，實(shí)驗(yàn)分3天、7天和21天三個(gè)時(shí)間段進(jìn)行觀察。 2.主要試劑及藥品：體積分?jǐn)?shù)為20﹪的百草枯溶液，英國(guó)捷利康有限公司農(nóng)藥部生產(chǎn)；PER測(cè)定需標(biāo)本存儲(chǔ)液及測(cè)定試劑盒由寶生物工程(大連)有限公司 TaKaRa Biotechnology(Dalian) Co，Ltd.提供；PDGF、IGF-1、TGF-β1試劑盒，美國(guó)R＆D公司進(jìn)口分裝，上海

3、森雄科技實(shí)業(yè)有限公司提供。 3.觀察指標(biāo)：各染毒組動(dòng)物均于觀察結(jié)束后采用下腔靜脈穿刺取血約5ml，靜置20min，離心后取血清，-70℃凍存，待檢測(cè)，死亡動(dòng)物于頻死前采血，取左肺上葉，冰鹽水洗滌后置于由大連寶生物提供標(biāo)本存儲(chǔ)液中封存，待RT-PCR組織檢測(cè)。血清TGF-β1、PDGF、IGF-1濃度采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，按說(shuō)明書規(guī)程操作。肺組織病理學(xué)的檢查：取右下肺組織，置于體積分?jǐn)?shù)為10﹪的甲醛溶液中固定，石蠟包埋

4、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡觀察。 結(jié)果: 1.血清細(xì)胞因子TGF-β13天組較之對(duì)照組明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)7天及21天組有下降但仍居高值，與對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，肺組織中RT-PCR定量表達(dá)中可看出3天、7天組與對(duì)照組比較有升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，21天各組與對(duì)照組比較有升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2．病理：7天以后，肺泡腔內(nèi)滲出液開(kāi)始機(jī)化，纖維細(xì)胞肥大，分泌纖細(xì)的膠

5、原纖維，形成較纖細(xì)的纖維組織，可見(jiàn)到肺泡腔內(nèi)纖維化的圖像。由于肺泡上皮損傷，其中Ⅱ型細(xì)胞的損傷使表面活性物質(zhì)缺乏，出現(xiàn)肺泡塌陷。肺泡腔內(nèi)膠原纖維的出現(xiàn)及肺泡塌陷，形成了塌陷性纖維化。以上病變?cè)趦芍芎竺黠@，再以后，肺泡腔內(nèi)滲出物的纖維化、肺泡及肺泡管透明膜的機(jī)化、肺泡隔纖維化進(jìn)行性進(jìn)展。(本標(biāo)本病理切片作了膠原纖維化染色，綠色部分均為肺間質(zhì)纖維化表現(xiàn))。 結(jié)論: 在百草枯中毒致肺纖維化發(fā)病過(guò)程中，TGF-β1存在規(guī)律性變化

6、，百草枯染毒后血清中TGF-β1明顯升高，至21天后仍維持在較高水平。而肺組織TGF-β1 mRNA表達(dá)染毒后3天和7天均明顯增多，而至21天則出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這一點(diǎn)與臨床上觀察到的百草枯中毒病程相符合，說(shuō)明在百草枯中毒過(guò)程中TGF-β1可能起到重要作用，然而其作用的詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。 目的: 1．探討百草枯中毒的作用機(jī)制。2．觀察細(xì)胞因子在百草枯中毒所致的急性反應(yīng)過(guò)程中所表現(xiàn)出變化規(guī)律。3．通過(guò)試驗(yàn)病理觀察百草枯

7、中毒肺纖維化變化的規(guī)律。 方法: 1．健康wistar大鼠72只，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、高劑量染毒組(120mg/kg)、中劑量染毒組(60mg/kg)和低劑量染毒組(30mg/kg)，每組6只大鼠。染毒組給予相應(yīng)劑量的百草枯溶液1ml灌胃，對(duì)照組給同時(shí)給予1ml蒸餾水，實(shí)驗(yàn)分8h、24h、72h三個(gè)時(shí)間段進(jìn)行觀察。 2.主要試劑及藥品：體積分?jǐn)?shù)為20﹪的百草枯溶液，英國(guó)捷利康有限公司農(nóng)藥部

8、生產(chǎn)：PDGF、IGF-1、TGF-β1試劑盒，美國(guó)R＆D公司進(jìn)口分裝，上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司提供。 3.觀察指標(biāo)：各染毒組動(dòng)物均于觀察結(jié)束后采用下腔靜脈穿刺取血約5ml，靜置20min，離心后取血清，-70℃凍存，待檢測(cè)，死亡動(dòng)物于頻死前采血。血清TGF-β1、PDGF、IGF-1濃度采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，按說(shuō)明書規(guī)程操作。肺組織病理學(xué)的檢查：取右下肺組織，置于體積分?jǐn)?shù)為10﹪的甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，蘇木

9、精-伊紅(HE)染色，光鏡觀察。 結(jié)果: 1.8h、24h、72h各劑量組細(xì)胞因子的水平在增加，如表1所示，24h與72h組與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.050r P<0.01)。72h高劑量組各指標(biāo)與同時(shí)間點(diǎn)低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。72h高、中、低三個(gè)劑量組與8h時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，隨染毒濃度的增加細(xì)胞因子水平在逐漸增加，隨時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞因子的水平也在

10、逐漸增加，存在有一定的線性趨勢(shì)，在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)的變化。 2.病理檢查示染毒后8h出現(xiàn)肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血、中性白細(xì)胞浸潤(rùn)，24h肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張及炎性粒細(xì)胞浸潤(rùn)更加明顯，有大量滲出液；72h出現(xiàn)廣泛彌漫的間質(zhì)纖維化的表現(xiàn)。 結(jié)論 研究發(fā)現(xiàn)，隨染毒濃度的增加，細(xì)胞因子水平也在逐漸增加。隨時(shí)間的延長(zhǎng)8h、24h、72h，細(xì)胞因子的水平也在逐漸增加，存在有一定的線性趨勢(shì)，在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)的變化。