浸潤性乳腺導(dǎo)管癌mtDNA突變及mt-mRNA、VEGF、BRCA-,1-和PTEN的表達(dá).pdf

1、乳腺癌是危害女性健康的主要惡性腫瘤之一，而浸潤性乳腺導(dǎo)管癌是乳腺癌當(dāng)中最常見的病理類型。研究證實，基因突變及表達(dá)是乳腺細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，并與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。線粒體脫氧核糖核酸(mitochodrialDNA，mtDNA)是核外唯一的遺傳物質(zhì)，遵循母系遺傳，因缺乏組蛋白保護(hù)，且損傷修復(fù)系統(tǒng)不完善，容易成為致癌物質(zhì)攻擊的靶子?，F(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)mtDNA與多種疾病和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。mtDNA的復(fù)制控制區(qū)(control

2、region forreplication，D-loop region)是線粒體非編碼區(qū)中較為重要的區(qū)域，參與并調(diào)解mtDNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄；該區(qū)域的某些變異可能會引起mtDNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的變化。mtDNA細(xì)胞色素b基因(cytochrome b gene，cyt-b)編碼氧化磷酸化呼吸鏈中的復(fù)合體Ⅲ(泛醌-細(xì)胞色素C還原酶)中的一個亞基，比較穩(wěn)定，是物種進(jìn)化領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，然而近年來的研究發(fā)現(xiàn)mtDNA cyt-b在多種疾病和腫瘤有改變，

3、但沒有發(fā)現(xiàn)乳腺癌mtDNA cyt-b的研究報道。mtDNA的表達(dá)以及特異性突變的不斷發(fā)現(xiàn)，為疾病的診斷和研究提供了可靠的客觀依據(jù)。 研究表明，血管內(nèi)皮生長因子(vasculaur endothelial growth factor，VEGF)和相關(guān)腫瘤抑制基因蛋白酪氨酸磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)、乳腺癌抑癌基因I(breas

4、t and ovarian cancer suppressor gene I，BRCAl)的表達(dá)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，并直接影響腫瘤的預(yù)后，PTEN、BRCA，等現(xiàn)在也已經(jīng)成為乳腺癌研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，但VEGF和乳腺癌的相關(guān)研究尚沒有文獻(xiàn)報道。 目的：1)檢測浸潤性乳腺導(dǎo)管癌mtDNA D-loop環(huán)高變區(qū)(1aypervariableregion，HV region)體細(xì)胞性突變，探討它在乳腺癌發(fā)生中的作用；2)

5、檢測mtDNAcyt-b區(qū)基因在乳腺癌組織、癌旁正常組織及血液樣本基因變異情況，尋找特異性位點(diǎn)；3)檢測mtDNA的拷貝量在乳腺癌中的變化，尋求診斷指標(biāo)；4)檢測mtDNA cyt-b基因和VEGF mRNA表達(dá)，探討它們在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用和相互關(guān)系；5)檢測VEGF、PTEN,BRCAl相關(guān)蛋白在乳腺癌中的表達(dá)和微血管密度(microvessel density，MVD)，探討它們在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用和相互關(guān)系。

6、 方法：1)對20例浸潤性乳腺導(dǎo)管癌(以下均簡稱為乳腺癌)的癌組織、癌旁正常組織和血液樣本進(jìn)行mtDNA cyt-b基因的聚合酶鏈．單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)，對其中有異常條帶的所有標(biāo)本進(jìn)行基因測序分析；2)采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和基因測序

7、(gene sequencing)方法，對上述結(jié)果陽性的乳腺癌患者的癌組織，進(jìn)行mtDNA非編碼區(qū)D-loop高突變HV2區(qū)部分序列突變分析；3)采用PCR技術(shù)，分別擴(kuò)增20例乳腺癌組織和20例癌旁正常組織的mtDNA D-loop的HV<,1>區(qū)和HV<,2>區(qū)，并以核基因組的β肌動蛋白(β-actin)作為定量標(biāo)準(zhǔn)物，以聚丙烯酰胺凝膠電泳法(polyacryamide gelelectrophoresis，PAGE)比較兩者mtDN

8、A拷貝量的差異；4)采用逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)，分別對19例乳腺癌組織和19例癌旁正常組織的mtDNA cyt-b和VEGF的mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測，并以核基因組的β-actin作為定量標(biāo)準(zhǔn)物，比較兩種基因mRNA表達(dá)的差異；5)采用S-P免疫組織化學(xué)法(streptavidin．peroxidase immunohistoche

9、micalmethod)，對42例乳腺癌組織和30例癌旁正常組織的VEGF、PTEN、BRCA<,1>蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測，同時檢測MVD，比較它們在乳腺癌和癌旁正常組織中的差異。 結(jié)果：①經(jīng)PCR-SSCP檢測，在20例乳腺癌mtDNA中共發(fā)現(xiàn)7例出現(xiàn)異常條帶，測序結(jié)果顯示，6個位點(diǎn)突變發(fā)生率較高：nt 15326 A→G(91％，20/21)；nt 14766 C→T(81％，17/21)；nt 15301 G→A(52％，1

10、1/21)；nt 15043 G→A(48％，10/21)；nt 14783 T→C(43％，9/21)；nt 15402 C→T(35％，7/21)；②7例HV2區(qū)測序標(biāo)本中，共檢測到31個新的突變位點(diǎn)，其中有3個屬于微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)，7例移碼突變，其余為點(diǎn)突變(pointmutation)，7個位點(diǎn)位于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)域；③HV1和HV2的拷貝量(以核基因組β-actin作

11、內(nèi)參)在乳腺癌組織小于癌旁正常組織(P<0.05和p<0.01)；④mtDNAeyt-b和VEGF的mRNA表達(dá)在乳腺癌組織中均高于癌旁正常組織(p<0.01)，且兩者呈正相關(guān)(p<0.01)；⑤VEGF蛋白的表達(dá)在乳腺癌組織高于癌旁正常組織(p<0.01)；其與VEGF的mRNA表達(dá)呈正相關(guān)性(p<0.01)；MVD與VEGF蛋白的表達(dá)均呈正相關(guān)性(p<0.05)；⑥PTEN和BRCA<,1>蛋白的表達(dá)在乳腺癌組織中低于乳腺癌旁正常組

12、織(p<0.01)；PTEN和BRCA<,1>與VEGF呈負(fù)相關(guān)(p<0.05)。 結(jié)論：1．浸潤性乳腺導(dǎo)管癌mtDNA HV2區(qū)是一個高度多態(tài)性和突變性的區(qū)域，它與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系；2．浸潤性乳腺導(dǎo)管癌mtDNAcyt-b的6個高突變發(fā)位點(diǎn)為乳腺癌的診斷和線粒體功能評價提供有價值的參考，而且ntl5326C→T；ntl4766C→T是浸潤性乳腺導(dǎo)管癌突變的熱點(diǎn)；3．浸潤性乳腺導(dǎo)管癌mtDNA拷貝量減少，與乳腺癌的發(fā)