聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)在檢測(cè)非霍奇金淋巴瘤克隆性重排中的應(yīng)用性研究.pdf

1、本研究首先采用PCR方法，聯(lián)合FR3A、FR2A及TCRγ引物，檢測(cè)82例NHL的IgH基因及TCRγ基因克隆性重排，測(cè)定了IgH基因及TCRγ基因克隆性重排在本實(shí)驗(yàn)室NHL中的檢測(cè)率。從中篩選出電泳結(jié)果為雙重重排的病例進(jìn)一步通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)證實(shí)和分析惡性淋巴瘤中雙重重排現(xiàn)象。同時(shí)，分別對(duì)5例B-NHL、6例反應(yīng)性淋巴結(jié)炎及6例正常人的血液標(biāo)本進(jìn)行梯度稀釋后行FR3A的PCR擴(kuò)增，模擬小標(biāo)本研究克隆性重排檢測(cè)中假陽(yáng)性產(chǎn)生的可能機(jī)制。然

2、后，對(duì)在樣本中篩選出的胃MALT-MZL與慢性胃炎的克隆性重排結(jié)果進(jìn)行分析，探討PCR技術(shù)檢測(cè)IgH基因克隆性重排在MALT-MZL與慢性胃炎鑒別診斷中的意義。最后，將克隆性重排的檢測(cè)應(yīng)用于臨床疑難病例，作為臨床應(yīng)用的嘗試。 研究材料： (1)NHL標(biāo)本：收集1997-2005年我醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及省內(nèi)其它醫(yī)院的NHL標(biāo)本82例，全部標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋、4～5μm連續(xù)切片，除常規(guī)HE染色外，采用LCA(2

3、B11，DAKO)、CD45Ro(OPD4，DAKO)、CD20(L26，DAKO)免疫組化S-P法標(biāo)記淋巴細(xì)胞亞群，根據(jù)腫瘤的免疫表型，劃分為B-NHL和T-NHL，82例標(biāo)本中有56例B-NHL和26例T-NHL。按照2000年WHO關(guān)于淋巴及造血系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有病例進(jìn)行分類。 (2)對(duì)照組標(biāo)本：收集反應(yīng)性淋巴結(jié)炎石蠟標(biāo)本6例，正常人血液標(biāo)本5例，14例存在淋巴濾泡增生的慢性胃炎石蠟標(biāo)本，其中包括4例診斷為慢性萎縮性胃

4、炎的胃鏡標(biāo)本，10例胃淋巴瘤切緣端非腫瘤部分的標(biāo)本。 研究方法： (1)經(jīng)典蛋白酶K-酚氯仿法抽提石蠟組織DNA，鹽析法抽提血液標(biāo)本DNA。 (2)采用PCR方法，聯(lián)合FR3A、FR2A及TCRγ引物，檢測(cè)82例NHL標(biāo)本IgH基因及TCRγ基因克隆性重排，產(chǎn)物先2％瓊脂糖電泳初篩，后行8％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。對(duì)電泳結(jié)果為雙重重排的病例進(jìn)行DNA測(cè)序分析。 (3)分別對(duì)5例B-NHL，6例反應(yīng)性淋

5、巴結(jié)炎及6例正常人的血液標(biāo)本進(jìn)行1∶2、1∶3、1∶10、1∶100、1∶200的梯度稀釋，F(xiàn)R3A的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物先用2％的瓊脂糖電泳初步判斷，后行8％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染后觀察。 (4)慢性胃炎標(biāo)本14例，行IgH的PCR分析，電泳分析同(3)。 研究結(jié)果： 1.采用FR3A引物，克隆性IgH基因重排在56例B-NHL中檢測(cè)率為64.3％(36/56)，聯(lián)合FR3A、FR2A引物，總檢測(cè)率為78.

6、9％(44/56)。 2.TCRγ克隆性重排在26例T-NHL中檢測(cè)率為46.2％(12/26)。 3.聯(lián)合FR3A、FR2A及TCRγ引物，6.0％(5/82)NHL檢測(cè)到發(fā)生雙重重排，均經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)。免疫組化結(jié)果提示這5例均為B細(xì)胞表型。病理類型分別為2例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)、2例MALT-MZL及1例濾泡性淋巴瘤(FL)。 4.5例淋巴瘤標(biāo)本在各個(gè)稀釋倍數(shù)克隆性重排的結(jié)果均表現(xiàn)為單克隆。6例

7、反應(yīng)性淋巴結(jié)炎和6例血液標(biāo)本，初始濃度及稀釋倍數(shù)為1∶2、1∶3時(shí)結(jié)果為多克隆，當(dāng)稀釋倍數(shù)為1∶10及以上時(shí)，結(jié)果出現(xiàn)假單克隆條帶。 5.用FR3A為引物擴(kuò)增，60％的胃MALT-MZL獲得單克隆條帶，聯(lián)合FR2A，可使其檢出率提高到70％。慢性胃炎標(biāo)本未檢測(cè)到IgH基因單克隆條帶。 研究結(jié)論： 1.采用FR3A引物，克隆性IgH基因重排在B-NHL中檢測(cè)率為64.3％，聯(lián)合FR3A、FR2A引物，可提高檢測(cè)率到

8、78.9％。 2.TCRγ克隆性重排在T-NHL中檢測(cè)率為46.2％。 3.雙重重排現(xiàn)象在惡性淋巴瘤中的發(fā)生率為6.0％。病理類型集中在DLBCL、MALT-MZL、FL。 4.對(duì)高度懷疑為淋巴瘤的臨床病理標(biāo)本進(jìn)行克隆性重排檢測(cè)時(shí)，必須對(duì)同一樣本同時(shí)檢測(cè)IgH和TCR基因，才能保證結(jié)果的完整性和真實(shí)性，兩者缺一不可。 5.在IgH克隆性重排檢測(cè)中，DNA模板梯度稀釋檢測(cè)的方法是目前鑒別假陽(yáng)性的方法之一。