核因子-κB在胰島素抵抗和糖尿病大鼠中的表達及格列喹酮對其表達水平的影響.pdf

1、第一部分實驗性胰島素抵抗大鼠模型的建立。
　　 目的：使用高脂飲食誘導胰島素抵抗(IR)大鼠模型，為進一步實驗研究做準備。
　　 方法：將60只2月齡雄性Wistar大鼠隨機分為青年正常對照組(A組)、青年胰島素抵抗組(B組)，中老年正常對照組(C組)及中老年胰島素抵抗組(D組)，每組15只，正常對照組(A、C組)給予普通飲食喂養(yǎng)，胰島素抵抗組(B、D組)使用高脂飲食喂養(yǎng)，監(jiān)測大鼠體重變化。喂養(yǎng)2個月后，測定血膽固醇、甘

2、油三酯等指標，同時對各組大鼠行高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗。比較各組間基礎血糖、血脂、血胰島素水平的差異。計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)、葡萄糖輸注速率(GIR)等指標。
　　 結果：大鼠體重隨著年齡的增加而增加，IR組較同年齡大鼠體重增加較為為明顯(p<0.05)。與正常對照組相比，I組大鼠血胰島素水平顯著升高，HOMA-IR顯著升高，GIR水平顯著下降，提示IR大鼠模型造模成功。14月齡組大鼠(C、D組)HOMA-IR值高

3、于相應4月齡組大鼠(A、B組)(P<0.05)，14月齡對照組大鼠HOMA-IR及葡萄糖鉗夾結果均明顯高于4月齡對照組，顯示出胰島素抵抗的特征。
　　 結論：高脂喂養(yǎng)方法可以建立穩(wěn)定的IR大鼠模型，此模型可用于胰島素抵抗疾病狀態(tài)的研究；隨著大鼠年齡的增長，胰島素抵抗指數及GIR水平顯著升高。研究結果提示高脂飲食、年齡增加等均是胰島素抵抗發(fā)生的獨立危險因素。
　　 第二部分NF-κB及T游炎癥因子在胰島素抵抗大鼠腎臟、心肌

4、中的表達。
　　 目的：1.探討胰島素抵抗大鼠腎臟組織中NF-κB及環(huán)氧合酶(COX-2)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等表達的變化及意義。2.探討胰島素抵抗大鼠心肌組織中NF-κB及單核趨化蛋白-1(MCP-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)等表達的變化及意義。
　　 方法：健康雄性Wistar大鼠30只從2月齡開始飼養(yǎng)，隨機分為正常對照組、胰島素抵抗組(每組15只)。以高脂高糖喂養(yǎng)法構造胰島素抵抗大鼠模型，并

5、使用高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗驗證模型的有效性。留取大鼠腎臟、心臟等組織。觀察各組大鼠腎臟、心肌結構的變化(HE)，免疫組化染色觀察腎臟組織中NF-κB、iNOS和COX-2等蛋白表達情況；觀察心肌細胞中NF-κB、MCP-1和ICAM-1等蛋白表達情況。實時定量逆轉錄.聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測腎臟組織中NF-κB、iNOS和COX-2mRNA表達情況；檢測心臟組織中NF-κB、ICAM-1和MCP-1mRNA表達情況。采用凝膠電

6、泳遷移率(EMSA)法測定各組大鼠腎臟組織NF-κB的DNA結合活性。
　　 結果：1.對胰島素抵抗模型進行正葡萄糖鉗夾實驗，IR組GIR水平較對照組明顯降低，提示造模成功。2.對照組腎小球及小管間質未見異常病理改變；胰島素抵抗模型組可見大鼠腎小球體積增大、系膜區(qū)增寬等腎臟組織早期受損表現。與對照組相比，胰島素抵抗組心肌HE檢查結果顯示病理改變并不明顯。3.免疫組化染色：對照組見極少數腎小球細胞核表達NF-κB，而胰島素抵抗組N

7、F-κB在腎小球細胞核中呈高水平表達。胰島素抵抗組腎小球細胞胞漿中COX-2和iNOS陽性表達亦顯著增加，平均吸光度值與對照組相比差異有顯著性意義(p<0.05)；胰島素抵抗組心肌組織中NF-κB、ICAM-1和MCP-1表達水平均較對照組明顯升高，平均吸光度值與對照組相比差異有顯著性意義(p<0.05)。4.RT-PCR:NF-κBmRNA水平在胰島素抵抗組明顯升高，相應的下游炎癥因子的表達水平在胰島素抵抗組中亦升高明顯。5.EMSA

8、:與對照組相比，胰島素抵抗組腎臟組織NF-κB結合活性顯著增加(p<0.05)。
　　 結論：胰島素抵抗大鼠腎臟、心臟等組織中存在NF-κB的激活，從而啟動下游靶基因MCP-1、ICAM-1、COX-2、iNOS等表達增加，進而導致腎臟、心肌等組織受損。NF-κB的激活可能是導致胰島素抵抗大鼠腎臟病變、心肌病變的始動因子之一，在糖尿病腎臟病變和心肌病變的發(fā)生發(fā)展中可能有重要意義。
　　 第三部分格列喹酮干預治療對糖尿病大

9、鼠腎臟組織及NF-κB與炎癥因子表達的作用。
　　 目的：探討格列喹酮干預治療對糖尿病腎臟病變中腎小球病理改變的影響以及對核因子-κB、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達的影響。
　　 方法：8月齡雄性Wistar大鼠24只隨機分成對照組、糖尿病組、格列喹酮干預組，每組各8只大鼠。對照組大鼠使用普通飲食喂養(yǎng)，糖尿病大鼠采用高糖高脂飲食+腹腔注射鏈脲菌素制備。格列喹酮干預組在糖尿病大鼠成模后給予

10、格列喹酮喂養(yǎng)干預。喂養(yǎng)2月后處死大鼠，留取各組大鼠腎臟標本，觀察腎臟病理改變.使用免疫組化方法檢測腎臟NF-κBP65、COX-2和iNOS等表達情況.使用RT-PCR檢測腎臟組織NF-κB、COX-2和iNOS等mRNA表達情況。應用EMSA方法檢測腎臟組織NF-κB激活情況。應用Westernblot方法檢測各組大鼠腎臟組織NF-κB蛋白表達。
　　 結果：1.糖尿病組大鼠在腹腔注射鏈脲菌素一周后測兩次隨機血糖均≥16.7m

11、mol/1，提示模型成功建立。2.從病理切片觀察，與對照組相比，糖尿病組和格列喹酮干預組大鼠均有不同程度腎臟受損表現，其中糖尿病組病理改變最為明顯。3.免疫組化分析結果顯示與正常對照組相比，糖尿病組腎臟NF-κB及COX-2、iNOS等表達均增加(p<0.05)。4.RT-PCR結果顯示與正常對照組相比，糖尿病組、格列喹酮干預組腎臟組織NF-κB及下游炎癥因子mRNA水平表達增加(p<0.05)。5.EMSA結果顯示糖尿病組腎臟組織NF

12、-κBDNA結合力較對照組明顯增強(p<0.05)，格列喹酮干預組NF-κBDNA結合力較糖尿病組明顯減弱(P<0.05)。6.Westernblot結果顯示糖尿病組及格列喹酮治療組NF-κB蛋白表達水平較正常組顯著升高，格列喹酮治療后NF-κB蛋白表達水平較糖尿病組明顯下降(p<0.05)。
　　 結論：NF-κB的激活及其啟動的下游炎癥因子在糖尿病腎臟病變的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，格列喹酮干預治療則可以抑制NF-κB的激活及