TNF-α與CD44在SD大鼠分泌性中耳炎的表達(dá)及意義.pdf

1、目的:分泌性中耳炎(Otitis media with effusion,OME)是以鼓室積液為特征的慢性非化膿性炎癥,其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確,通常認(rèn)為與咽鼓管機(jī)械性阻塞、感染、免疫反應(yīng)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立OME大鼠模型,研究TNF-α與CD44在SD大鼠聽(tīng)泡粘膜上皮中的表達(dá)變化,探討TNF-α與CD44在OME發(fā)生、發(fā)展中所起的作用。
　　 方法:成年健康SD大鼠40只,設(shè)立正常對(duì)照組、手術(shù)對(duì)照(PBS)組、OME模型組三個(gè)實(shí)

2、驗(yàn)組。正常對(duì)照組選SD大鼠4只,不作任何處理,直接取聽(tīng)泡表面粘膜及聽(tīng)泡灌洗液檢測(cè)；手術(shù)對(duì)照(PBS)組選用SD大鼠16只分別在中耳腔內(nèi)注射磷酸緩沖液(PBS),按2天、4天、7天、15天四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)處死SD大鼠后取聽(tīng)泡灌洗液和聽(tīng)泡粘膜組織檢測(cè)；OME模型組在中耳腔注射脂多糖(LPS)后,與手術(shù)對(duì)照(PBS)組相對(duì)應(yīng),按四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)取聽(tīng)泡粘膜組織及大鼠聽(tīng)泡灌洗液行檢測(cè)(各時(shí)間段均多選入一只SD大鼠,以防出現(xiàn)造模過(guò)程中動(dòng)物死亡所致實(shí)驗(yàn)動(dòng)

3、物數(shù)量不夠之情況)。聽(tīng)泡灌洗液運(yùn)用ELISA法檢測(cè)各組中腫瘤壞死因子(TNF-α)濃度。聽(tīng)泡粘膜組織通過(guò)固定、包埋制成切片,運(yùn)用HE染色法查看各組大鼠聽(tīng)聽(tīng)泡粘膜組織細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變,采用免疫組化SP法檢測(cè)聽(tīng)泡粘膜中粘附分子CD44及TNF-α在不同實(shí)驗(yàn)組中的陽(yáng)性表達(dá),用Image—Pro Plus6.0多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論。
　　 結(jié)果:1、采用ELISA法對(duì)正常對(duì)照組聽(tīng)泡灌洗液中的TNF-

4、α濃度進(jìn)行檢測(cè),其平均濃度為:91.831ng／ml。手術(shù)對(duì)照(PBS)組聽(tīng)泡灌洗液中平均TNF-α濃度在術(shù)后2天、4天、7天、15天時(shí)為148.858ng／ml、169.898ng／ml、135.753ng／ml、101.830ng／ml。OME實(shí)驗(yàn)組,聽(tīng)泡滲液中的TNF—α平均濃度分別為201.020ng／ml、235.774ng／ml、230.681ng／ml、116.958ng／ml。OME實(shí)驗(yàn)組灌洗液的TNF—α濃度在受LPS

5、影響后的七天左右最高,其后逐漸減輕,在15天時(shí),炎癥因子降至最低點(diǎn)。以a=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),做組間配對(duì)t檢驗(yàn),OME實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組和手術(shù)對(duì)照(PBS)組比較有明顯差異(P<0.05)。提示在OME大鼠模型,TNF—α的濃度在OME實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組。2、HE染色切片可見(jiàn),正常對(duì)照組聽(tīng)泡粘膜無(wú)炎癥改變；手術(shù)對(duì)照(PBS)組術(shù)后2天、4天、7天、15天均未見(jiàn)聽(tīng)泡粘膜上皮細(xì)胞有明顯改變,僅粘膜下有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；OME實(shí)驗(yàn)組術(shù)后兩天

6、可見(jiàn)聽(tīng)泡粘膜水腫,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),其中有大量中性粒細(xì)胞。術(shù)后四天組見(jiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增強(qiáng),以大量中性粒細(xì)胞為主。術(shù)后七天組可見(jiàn)上皮下間隙增寬,更多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),仍以大量中性粒細(xì)胞為主。術(shù)后15天組出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增生,新生血管增多,并可見(jiàn)到單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),中耳粘膜明顯增厚的改變。3、免疫組化SP染色,正常對(duì)照組TNF-α和CD44均在粘膜上皮及上皮下結(jié)締組織僅少量表達(dá)。手術(shù)對(duì)照(PBS)組TNF-α和CD44染色陽(yáng)性的細(xì)胞表達(dá)

7、部位與正常對(duì)照組無(wú)變化,且四個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間表達(dá)強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05),無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OME實(shí)驗(yàn)組聽(tīng)泡粘膜上皮細(xì)胞和粘膜下結(jié)締組織中均有TNF—α和CD44陽(yáng)性表達(dá),尤其在杯狀細(xì)胞及粘膜下混合腺?gòu)?qiáng)烈表達(dá),其術(shù)后15天強(qiáng)烈表達(dá)。經(jīng)Image—Pro Plus6.0檢測(cè)雙側(cè)聽(tīng)泡粘膜陽(yáng)性細(xì)胞灰度值,使用SPSS13.0采用組間t檢驗(yàn)、相關(guān)性分析。OME實(shí)驗(yàn)組與手術(shù)對(duì)照(PBS)組和正常對(duì)照組TNF—α和CD44陽(yáng)性表達(dá)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、分析發(fā)現(xiàn):OME實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間兩種因子的表達(dá)強(qiáng)度有明顯差異(P<0.05)。通過(guò)相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)OME實(shí)驗(yàn)組內(nèi),TNF-α和CD44表達(dá)明顯相關(guān)。手術(shù)組不同時(shí)間段TNF—α和CD44陽(yáng)性表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05),無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:1、在OME大鼠模型急性期,鼓室積液的中TNF-α濃度與炎癥的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。2、TNF-α介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的方式可能是激活中性粒細(xì)胞。在這一過(guò)程中,粘附分子CD44參與了中性粒細(xì)胞的粘