利用重組大腸桿菌生產(chǎn)PHB-co-PHBV嵌段共聚物的研究.pdf

1、聚羥基脂肪酸酯(PHA)是微生物天然合成的一類功能性生物聚酯，由于PHA具有與傳統(tǒng)石油化工類塑料相似的材料性質(zhì)，因此PHA一直以來都被認為是傳統(tǒng)石化類塑料的最佳替代品。PHA材料具有良好的生物可降解性、生物相容性、光學活性和壓電性等，在日常生活、醫(yī)療衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、燃料供給以及儀器配件等方面都有廣泛的應用前景。
　　聚羥基丁酸酯(PHB)和聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)是短鏈PHA家族的兩個成員，是目前研究比較透徹的兩種PHA聚

2、酯。PHB是由同一種單體（3-羥基丁酸）聚合而成的，而PHBV是由兩種單體（3-羥基丁酸和3-羥基戊酸）共聚而成的，因此PHBV的材料學性能比PHB有了很大提高。但是由于PHBV是隨機共聚物，其結晶過程會呈現(xiàn)同二晶現(xiàn)象，對加工過程非常不利。而嵌段共聚物不同于隨機共聚物，能夠避免同二晶現(xiàn)象。由于嵌段共聚物分子量可控、分子量分布較窄、分子結構與組成可設計、性能更優(yōu)越，因此是高分子研究領域中最富有意義且具有挑戰(zhàn)性的研究工作之一。本論文的研究目

3、的就是在重組大腸桿菌中，利用合成生物學的設計和調(diào)控，生產(chǎn)PHB-co-PHBV嵌段共聚物。
　　本研究的第一部分是構建嵌段共聚物生產(chǎn)的基礎菌株。實驗室之前的研究表明，重組大腸桿菌可以利用非相關碳源，如葡萄糖、木糖等，經(jīng)過蘇氨酸代謝途徑，合成3HV含量較高的PHBV。本論文以此為基礎，在大腸桿菌的基因組上，對天冬氨酸激酶thrA進行了點突變和啟動子替換，解除了蘇氨酸的反饋抑制，使該途徑的轉(zhuǎn)錄水平提高了11倍以上，蘇氨酸的積累能力提高

4、了9.5倍，能夠為嵌段共聚物的生產(chǎn)提供足夠的底物。隨后，我們利用本實驗室構建的Flp/FRT位點專一性重組方法，將嵌段共聚物合成所需的操縱子序列多拷貝的整合到重組菌株的基因組上。通過檢測，整合拷貝數(shù)為1-9個不等。由此我們成功構建了嵌段共聚物生產(chǎn)的底盤生物。通過發(fā)酵檢測，當表達另一關鍵酶ilvACG時，該基礎菌株能夠在細胞內(nèi)積累3HV含量較高的PHBV;當不表達ilvACG時，該基礎菌株能夠積累PHB。這為嵌段共聚物的生產(chǎn)打下了基礎。<

5、br>　　本研究的第二部分是利用基因回路生產(chǎn)嵌段共聚物的初步研究。在構建好基礎菌株后，我們利用合成生物學方法，設計了用于控制基因表達的基因回路。我們將來自于費氏弧菌的群體感應系統(tǒng)luxRI和蘇云金芽孢桿菌的高絲氨酸內(nèi)酯酶基因aiiA，構建成基因回路，來周期振蕩地調(diào)控嵌段共聚物生產(chǎn)中的關鍵基因ilvACG。實驗初期我們以sfGFP作為報告基因，對構建的基因回路進行了調(diào)整和修飾，研究了組成型啟動子、luxR的表達模式、蛋白降解速率以及信號分