同源內(nèi)皮祖細(xì)胞對大鼠糖尿病潰瘍模型影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著糖尿病發(fā)生率的不斷增高，糖尿病皮膚潰瘍也日益成為外科醫(yī)生共同關(guān)注的焦點(diǎn)之一。其中，潰瘍發(fā)生的部位以足部為多。國際糖尿病足病工作組(IWGDF)將糖尿病足病定義為糖尿病患者踝以下累及全層皮膚的創(chuàng)面，而與這種創(chuàng)面的病程無關(guān)。糖尿病是目前全世界第三大常見疾病(心臟血管病、腫瘤、糖尿病)，國外，糖尿病患者并發(fā)糖尿病足的機(jī)會高達(dá)15％，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院的一項(xiàng)臨床研究顯示，住院糖尿病患者并發(fā)糖尿病潰瘍的發(fā)生率達(dá)到了2.058％。糖尿病足也成

2、為皮膚慢性潰瘍的重要組成及代表。 糖尿病足給病人及社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在美國，糖尿病性足部潰瘍每年費(fèi)用達(dá)15億美元，在英國每年用于糖尿病足潰瘍的治療的費(fèi)用達(dá)1.7億英鎊，這些費(fèi)用僅包括換藥治療和社區(qū)醫(yī)護(hù)人員支出，而并不包括由此而來的病人生活質(zhì)量下降、經(jīng)濟(jì)受損等后果；在國內(nèi)，雖然沒有關(guān)于類似的統(tǒng)計(jì)資料，但隨著糖尿病足的發(fā)病率逐年上升，醫(yī)院及社會在此方面的支出也在逐年增長。 糖尿病足不僅增加了病人和社會的經(jīng)

3、濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且，糖尿病潰瘍創(chuàng)面的存在，輕則增加病人痛苦，影響正常工作和生活；重則危及生命。大面積潰瘍創(chuàng)面的存在，可以影響機(jī)體的代謝、營養(yǎng)和免疫功能，甚至招來致命性的全身性感染。由于血液供應(yīng)差，且多有神經(jīng)病變，糖尿病足潰瘍傷口愈合緩慢、臨床治療困難。出現(xiàn)壞疽機(jī)會較正常人群為高，往往需要進(jìn)行截肢手術(shù)。而有些病人截肢后傷口仍不能愈合，不得不接受再次截肢手術(shù)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，一側(cè)截肢的病人在第2年對側(cè)肢體截肢率高達(dá)30％，造成病人極大痛苦。因此促進(jìn)潰瘍愈

4、合，盡快地封閉創(chuàng)面，是臨床治療中的重要課題。 隨著對創(chuàng)面愈合認(rèn)識的深化，人們認(rèn)識到，打破慢性創(chuàng)面的停滯狀態(tài)，使病理愈合模式向生理愈合模式轉(zhuǎn)變，是治療慢性創(chuàng)面的基本原則；治療工作及研究已從被動(dòng)等待狀態(tài)轉(zhuǎn)向主動(dòng)調(diào)控。 近年來，隨著對創(chuàng)面愈合過程的不斷深入，學(xué)者們紛紛認(rèn)識到，打破慢性創(chuàng)面的停滯狀態(tài)，啟動(dòng)創(chuàng)面的愈合的過程，需要針對創(chuàng)面不同的原發(fā)病，以及針對創(chuàng)面的不同時(shí)期，進(jìn)行有針對性的治療。本世紀(jì)初，美國學(xué)者首先提出來“創(chuàng)面床準(zhǔn)

5、備(Wound Bed Preparation，WBP)”理論，成為創(chuàng)面處理理論方面的里程碑。本課題組在既往的工作中，運(yùn)用WBP理論，已做了大量有益的嘗試，取得了一定的成績。 本課題即是在此背景下，在以往的工作基礎(chǔ)上，對WBP理論指導(dǎo)創(chuàng)面治療進(jìn)行有益的嘗試。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?本研究將在既往研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究：1、在充分創(chuàng)面床準(zhǔn)備條件下，體外誘導(dǎo)及培養(yǎng)大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endophilial Pro

6、genitor Cell，EPC)，并將同源內(nèi)皮祖細(xì)胞移植于大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面對愈合的影響。2、胰島素樣生長因子(Insulin—like Growth Factor-1，IGF-1)提純、擴(kuò)增及鑒定，為進(jìn)一步研究做前期準(zhǔn)備。 實(shí)驗(yàn)方法：本實(shí)驗(yàn)共分二部分。 第一部分：同源內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)移植于大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面對愈合的影響。①大鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外誘導(dǎo)及鑒定：用Ficoll—Paque離心法，分離Wister大鼠

7、外周血單個(gè)核細(xì)胞，將分離得到的細(xì)胞置于含10％FCS、VEGF 10 ng·L-1、bFGF 2 ng·L-1的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以Flk-1和vW因子的免疫熒光鑒定培養(yǎng)細(xì)胞；②糖尿病潰瘍大鼠動(dòng)物模型的建立：3月齡雄性普通級Wistar大鼠10只，體重200～250 g。以四氧嘧啶法，復(fù)制糖尿病模型，并制造潰瘍創(chuàng)面，以模擬糖尿病慢性創(chuàng)面紅期階段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；③同源內(nèi)皮祖細(xì)胞移植于大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面，通過實(shí)驗(yàn)研究了解效果。即：觀察創(chuàng)面

8、愈合時(shí)間；創(chuàng)面全愈當(dāng)天處死大鼠，取原創(chuàng)面組織切片，行VEGF免疫組化染色，NIKON80i光學(xué)顯微鏡下照相，NIKON ACT-2u軟件攝入電子計(jì)算機(jī)；以Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對創(chuàng)面VEGF在照片視野中的面積、累積光密度進(jìn)行分析，反映VEGF含量變化; PHILIPS CM10透射電鏡對創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)電鏡觀察。此步驟以5只正常大鼠皮膚組織做正常對照。第二部分：胰島素樣生長因子1(IGF-1)真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)

9、粒的構(gòu)建：Trizol自人肝臟組織提取cDNA，RNA，經(jīng)RT-PCR、PCR擴(kuò)增，電泳鑒定目標(biāo)DNA；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備、酶切鑒定目標(biāo)基因質(zhì)粒。 結(jié)果： 經(jīng)過研究，課題組達(dá)到了預(yù)期的研究目的：(1)成功地將大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞，并利用免疫熒光的方法對其進(jìn)行鑒定；(2)復(fù)制了穩(wěn)定的糖尿病潰瘍大鼠動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)劑量的四氧嘧啶(150mg／kg)可安全地復(fù)制糖尿病大鼠模型；控制血糖在11

10、-14mmol／l對維持模型的存活是安全的；(3)局部移植EPC于模型，其愈合速度加快，組織中VEGF含量顯著增高，血管增生明顯；電鏡下血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)良好。證實(shí)EPC對創(chuàng)面愈合有促進(jìn)作用。(4)成功構(gòu)建pMDl8-T-hIGF-1質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究IGF-1對慢性創(chuàng)面的愈合作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 結(jié)論①利用Ficoll-Paque離心法可以經(jīng)濟(jì)有效地自外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離并誘導(dǎo)培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞；本實(shí)驗(yàn)在體外誘導(dǎo)大鼠外周血單核細(xì)胞分化

11、為內(nèi)皮祖細(xì)胞，為移植自體大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞的研究打下了基礎(chǔ)。②適當(dāng)劑量的四氧嘧啶(150mg／kg)單次腹腔內(nèi)給藥，可安全地復(fù)制糖尿病大鼠模型；控制血糖在11-14mmol／l對維持模型的存活是安全的：③EPC局部移植可以促進(jìn)糖尿病足慢性創(chuàng)面的愈合，其可能的原因是EPC移植，促進(jìn)了VEGF分泌，增加了創(chuàng)面的微血管，改善了局部的微循環(huán)；④成功構(gòu)建pMD18-T-hIGF-1質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究pMD18-T-hIGF-1慢病毒轉(zhuǎn)染、修飾EPC后