激活內皮祖細胞wnt-β-catenin信號通路有助于糖尿病大鼠后肢缺血的細胞移植治療.pdf

1、目的：血管內皮修復和血管新生的細胞學材料為內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）和內皮細胞。主要通過體內外實驗研究高糖環(huán)境誘發(fā)氧化應激反應是否影響內皮祖細移植治療糖尿病后肢缺血效果，探討氧化應激反應如何引起wnt/β-catenin信號通路失衡，進而導致EPCs移植療效受限。
　　方法：體外實驗：快速處死大鼠，收集下肢骨髓腔中細胞（MNCs），采用Ficoll密度梯度離心法、貼壁培養(yǎng)法分離

2、和培養(yǎng)內皮祖細，使用連續(xù)形態(tài)觀察、鑒定EPCs；使用分子探針經流式細胞儀檢測（DCFH-DA）檢測正常糖濃度（N=）處理后EPCs的氧化應激水平變化；據不同方法分為7組：N、HG、HG+DMSO（XAV-939溶劑）、DM+Licl（β-catenin的激活劑）、HG+tempol（氧化應激抑制劑）、HG+H2O2、HG+tempol+XAV-939（β-catenin的抑制劑）處理EPCs后，使用結晶紫法檢測EPCs黏附TNFa預處理

3、HUVEC的的細胞數量，使用免疫蛋白印跡法檢測其wnt/β-catenin信號通路重要相關蛋白 T-β-catenin(總β-catenin)、NP-β-catenin（非磷酸化-β-catenin）以及介導的相關黏附功能蛋白VCAM-1表達的情況。體內實驗：鏈脲佐菌素腹腔打（STZ）針構建糖尿病大鼠模型，持續(xù)監(jiān)測血糖2月，建立糖尿病動物模型，使之進食高脂飼料，手術顯微鏡下行左側股動脈及其大分支結扎離斷術以建立糖尿病單側后肢缺血模型，并

4、觀察未進行EPCs移植情況下，血流恢復情況，以判斷是否造模成功。將健康、同窩大鼠后肢骨髓中單核細胞經上述方法分離、培養(yǎng)出 EPCs，術后24小時內按107/100g量經尾靜脈移植入大鼠動物模型體內，在術前、術后（0d）、7d、14d、28d行連續(xù) LDPI檢查以觀察移植治療效果。分為三組：健康大鼠后肢缺血模型經尾靜脈注射生理鹽水（H+NS）、糖尿病大鼠后肢缺血模型經尾靜脈注射生理鹽水（DM+NS）和糖尿病大鼠后肢缺血模型經尾靜脈注射內皮

5、祖細胞（DM+EPCs），術后28天抽取外周血經分光光度儀檢測氧化應激代謝產物MDA和抗氧化指標SOD水平。分為七組處理：H+NS、DM+NS,DM+EPCs、DM+EPCs+DMSO、DM+EPCs+tempol、DM+EPCs+Licl、DM+EPCs+XAV-939和DM+EPCs+tempol+XAV-939，經方法分離出來的 EPCs，經 PKH-26標記示蹤后，按107/100g量經尾靜脈移注射入各組后肢缺血大鼠模型體內，在

6、術前、術后（0d）、7、14、28行連續(xù)LDPI檢查，并在術后28天取大鼠左后肢腓腸肌和外周血，采用ELISA檢測血清中wnt3a、wnt5a和wnt7a的量，并篩選可能的起作用調節(jié)因子；抽取外周血經分光光度檢測氧化應激代謝產物MDA和抗氧化指標SOD水平；經ROS分子探針DCFH-DA和DHE在熒光顯微鏡下觀察缺血腓腸肌中氧化應激水平；在熒光顯微鏡鏡下觀察缺血腓腸肌血管內皮標志物CD31示血管數量和PKH-26示蹤的遷移、黏附細胞數量

7、；使用Western blotting檢測缺血腓腸肌wnt/β-catenin信號通路重要相關蛋白 T-β-catenin(總β-catenin)、NP-β-catenin（非磷酸化-β-catenin）以及介導的相關黏附功能蛋白VCAM-1表達的情況。
　　結果：經專用培養(yǎng)基EGM-2培養(yǎng)觀察：2d，培養(yǎng)的EPCs為貼著培養(yǎng)孔板生長，呈圓形，少有呈橢圓形。7d，細胞增大、變?yōu)槊黠@橢圓形或梭形生長；14d，觀察可發(fā)現細胞出現“鵝卵

8、石”樣、漩渦樣生長。通過激光共聚焦顯微鏡下見，細胞可見經過 DiI-ac-LDL處理后陽性的 EPCs為紅色熒光，結合了FITC-UEA-1后的EPCs為黃色熒光，雙染法陽性的細胞為正在分化的EPCs。結扎左側后肢的股動脈及其主要分支后經激光多普勒測定血流量比值，無論糖尿病體內，還是 EPCs處于高糖環(huán)境中，兩者的活性氧產物都增加（P<0.05）。糖尿病組體內MDA水平比健康大鼠體內MDA水平高(P<0.05)，且手術和移植EPCs操作

9、均對大鼠MDA水平無影響(P>0.05)；糖尿病大鼠與正常大鼠體內氧化相比應激水平增高，并導致抑缺血后肢血流恢復的受限，且能被氧化抑制劑所逆轉。糖尿病體ROS增加的情況下，T-β-catenin、NP-β-catenin相對蛋白表量減少，特別是 NP-β-catenin減少明顯，與正常組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，進而通過Licl和XAV-939調節(jié)T-β-catenin、NP-β-catenin表達量，可以引起移植治療血流恢復

10、的改變：缺血后肢遷移的EPCs數量、新生血管數量和血流值大小與其表達量成正相關關系。血清中Wnt5a與糖尿病缺血下肢血流改善有密切關聯，而wnt3a、wnt7a變化不符合血流恢復趨勢。糖尿病體內wnt/β-catenin信號低下，引起 VCAM1-1表達減少(P<0.05)；而體外高糖處理 EPCs后， wnt/β-catenin信號通路低下可能引起VCAM-1的降低(P<0.05)，也許能導致EPCs黏附到缺血部位的能力減弱(P<0.