EGF納米微粒促糖尿病大鼠潰瘍愈合作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：制備表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)納米微粒并對(duì)其微粒形貌、粒徑、載藥率、包封率和釋放情況進(jìn)行評(píng)價(jià)；進(jìn)行EGF納米微粒的體外細(xì)胞研究，應(yīng)用小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系，采用MTT法進(jìn)行EGF納米微粒的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)和評(píng)價(jià)EGF納米微粒生物學(xué)活性，研究微粒載體的毒性。采用EGF納米微粒治療DM大鼠潰瘍，比較EGF納米微粒和EGF兩種不同劑型對(duì)糖尿病(diabetes mellitus，DM)

2、大鼠潰瘍作用的差異，探討EGF納米微粒促愈合作用的機(jī)制。 方法： 1．利用改進(jìn)的復(fù)乳法，以聚乳酸-羥基乙酸(poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)作為載體，制備EGF納米微粒。 2．透射電子顯微鏡(transmissionelectron microscope，TEM)對(duì)EGF納米微粒形貌表征。 3．激光粒度儀/zeta電位儀分析微粒粒徑分布。 4．應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法

3、(enzyme linked immunosorbentassay，ELIsA)測(cè)定EGF納米微粒載藥率、包封率和釋藥行為。 5．L929細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，控制細(xì)胞濃度在1.0×10<'5>/ml，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板上。 6．以含有1μg/L，5μg/L，10μg/L，50μg/L，100μg/L濃度的EGF納米微粒懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)設(shè)立對(duì)照，培養(yǎng)24小時(shí)，用噻唑藍(lán)(Thiazolylblue，MTT)法測(cè)定49

4、0nm處的0D值，研究不同濃度EGF納米微粒對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。 7．以10μg/L濃度的EGF納米微粒，EGF原液，空微粒加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。培養(yǎng)24小時(shí)，用MTT法測(cè)定490nm處的0D值，研究相同濃度不同劑型EGF對(duì)細(xì)胞增殖的影響。 8．以含有0.01μg/L，0.1 μg/L，1μg/L，10μg/L，100μg/L,EGF濃度相對(duì)應(yīng)的納米空微粒為梯度，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，培養(yǎng)24小時(shí)，用MTT、

5、法測(cè)定490nm處的0D值，研究空微粒對(duì)細(xì)胞是否存在毒性，是否影響細(xì)胞增殖。 9．尾靜脈注射STZ法制備DM大鼠模型。 10．用打孔器制備DM大鼠潰瘍模型。 11．DM潰瘍大鼠分為4組：分別為EGF納米微粒組(A組)，EGF原液組(B組)，空白微粒組(c組)，PBS溶媒對(duì)照組(D組)，每天給藥一次。 12．分別于3、7、14、21天照相，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。 13．分別于3、7、14、21天取材，送病

6、理做HE切片和免疫組化(表皮生長(zhǎng)因子受體，epidermalgrowth factor receptor EGFR，增殖核細(xì)胞抗原，proliferating cell nuclearantigen，PCNA)。 14.于14天取材，做電鏡觀察。 結(jié)果： 1．EGF納米微粒粒徑大小為150nm，粒徑分布比較均一，微粒之間無(wú)粘連，分散性好。載藥率為0.02％，包封率為85％。釋藥符合釋放動(dòng)力學(xué)模型，微粒在快速滲透階

7、段快速釋放EGF使其達(dá)到藥物有效濃度，隨后在中速滲透階段和聚合物降解過(guò)程中在有效藥物濃度范圍內(nèi)緩慢釋放EGF，釋放長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)。 2．不同濃度EGF納米微粒均促進(jìn)細(xì)胞增殖，其中10μg/L為最適濃度(與對(duì)照組比，P<0.01)。 3．10μg/L濃度不同劑型EGF對(duì)細(xì)胞增殖的影響，四組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，EGF納米微粒組與EGF原液組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，兩組與空白對(duì)照和空微粒組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

8、義(P<0.01)，空白對(duì)照組和空微粒組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4．不同濃度空微粒對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，不影響細(xì)胞增殖(組間沒(méi)有差異，P>0.05)。 5．成功制備DM大鼠模型，一次成模率80.7％，二次追加全部成模。 6．愈合率顯示：在14天開(kāi)始，A組與B組有差別(P<0.05)。 7．EGFR顯示：在7天以后，A組與B組有顯著差異(P<0.01)。PCNA顯示：在14天，A組與B組有顯著差異(

9、P<0.01)。 8．電鏡結(jié)果顯示：A組成纖維細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量最多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，內(nèi)含大量膠原蛋白，其他各組成纖維細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量少，膠原顆粒少。 結(jié)論：成功制備EGF納米微粒。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明EGF納米微粒制備過(guò)程中EGF保持原有活性，EGF納米微粒與EGF原液比較，EGF納米微粒促進(jìn)L929細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，微粒載體對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用。EGF納米微粒與EGF原液比較，在治療DM大鼠潰瘍中，促進(jìn)潰瘍愈合更快，更適用于臨床的應(yīng)