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文檔簡介
1、背景:
傳統(tǒng)的觀點認為腫瘤的發(fā)生是一個多步驟的過程,涉及到外界因素的刺激、癌基因的激活、抑癌基因的失活等一系列的過程。但人們在研究大腸癌時發(fā)現(xiàn),腸道上皮細胞存活期短,沒有足夠的時間積累基因突變引起腫瘤,因此研究人員把目光投入到能夠長期存在未分化的干細胞而不是已分化的腫瘤細胞。1997年Bonnet等[1]分離出人急性粒細胞白血病干細胞,發(fā)現(xiàn)僅占0.2%的具有CD34+CD38-表型的腫瘤細胞能夠使NOD/SCID小鼠體內(nèi)形
2、成瘤,而其它表型的大部分細胞無法形成腫瘤。2001年Reya等[2]首次提出了腫瘤干細胞(TSC)學說,認為腫瘤組織中存在少量具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能的腫瘤干細胞,它在腫瘤組織中所占比例雖然很少,卻與腫瘤起源、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、放化療抵抗關系密切[3-5],而其它大部分腫瘤細胞經(jīng)過幾代短暫的分化后最終死亡。隨后陸續(xù)在大腸癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等各種實體腫瘤中培養(yǎng)出腫瘤干細胞,并對其細胞標記物、生物學特性進行了研究。
3、 現(xiàn)在比較公認的腦腫瘤干細胞(BTSCs)表面標記物是細胞表面粘附分子CD133[6]。Singh等[7]培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞球,接種100個CD133陽性細胞使NOD/SCID小鼠致瘤,所形成的腫瘤與原腫瘤表型一致。但隨著腫瘤干細胞研究的進展,研究人員發(fā)現(xiàn)CD133作為腫瘤干細胞具有一定局限性。Myung和Woolard等[8]研究發(fā)現(xiàn)大約40%新鮮分離的膠質(zhì)母細胞瘤標本并不表達CD133陽性腫瘤細胞;Wang等[9]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤中存在部分
4、CD133陰性的腫瘤細胞仍具有致瘤性,在此研究中發(fā)現(xiàn)CD133陰性細胞具有分化為CD133陽性細胞的能力,因此認為此類CD133陰性細胞也為腦腫瘤干細胞(BTSCs)。2011年Rath,P等培養(yǎng)鑒定出腦膜瘤干細胞,并對其表面標記物進行了研究,認為CD133并非僅有的腦腫瘤干細胞的標記物,CD166也是一種有價值的干細胞標記物。
腦膜瘤是一種常見的顱內(nèi)腫瘤,約占顱內(nèi)腫瘤的20%[11],以手術治療為主,90%腦膜瘤為WHO
5、Ⅰ級,WHOⅡ腦膜瘤約占4.6%-7.2%,WHOⅢ腦膜瘤約占1%-3%[12]。腦膜瘤的術后復發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響患者預后的關鍵。腦腫瘤干細胞標記物CD133及CD166為抗腫瘤治療提供了新思路和可能的治療靶點。前期大量的文獻證實,CD133和CD166表達水平和多種腫瘤預后密切相關,是腫瘤預后相關因素之一。本研究應用免疫組織化學法檢測腦膜瘤組織中干細胞標記物CD133和CD166的表達,探討腫瘤組織中CD133和CD166陽性細胞分布情況
6、和臨床意義,以及CD166作為腦膜瘤干細胞的標記物的可行性。
目的:
本研究采用免疫組化學技術,對比觀察CD133與CD166在不同級別腦膜瘤中的表達,探討兩者相關性及臨床意義,為腦膜瘤診斷、治療尋找更好的靶點。
實驗過程:
1.材料和方法
1.1 臨床資料80例腦膜瘤樣本來源于珠江醫(yī)院病理科2006年至2009年保存的石蠟標本。均經(jīng)病理學專家確診,按照WHO(200
7、7)腦腫瘤分類標準進行分類、分級,其中Ⅰ級腦膜瘤33例;Ⅱ級44例,其中非典型腦膜33例,其它11例;Ⅲ級3例,均為間變性腦瘤。按級別分為兩組,Ⅰ級腦膜瘤為低級別,Ⅱ-Ⅲ級腦膜瘤為高級別。
1.2 試劑及免疫組化方法 CD166兔抗人多克隆抗體(北京博奧森公司),CD133兔抗人多克隆抗體(北京中杉金橋公司),及免疫組化試劑盒(Biogenex公司)。標本經(jīng)10%福爾馬林溶液固定,石蠟包埋,切片的厚度為5um,脫蠟水化,修
8、復抗原。操作嚴格按照說明書進行。每批染色以結腸癌標本作為CD133和CD166的陽性對照,以PBS液代替一抗體作為陰性對照。
1.3 結果判斷標準CD133及CD166陽性表達為定位于細胞膜及細胞質(zhì),出現(xiàn)棕黃色且高出背景色。腫瘤組織的整體陽性表達程度用棕黃色物質(zhì)的積分光密度(IOD)值表示。圖像定量分析的過程:高倍鏡(400×)下隨機選擇10個視野,使用Image-Pro Plus6.0病理圖像分析軟件計算出陽性細胞IOD
9、值。
2.實驗步驟
石蠟切片經(jīng)過脫蠟和水化后,對組織進行高壓鍋熱修復。自然狀態(tài)下冷卻,蒸餾水沖洗2次,每次5min,用0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate bufferedsaline,PBS)浸泡3次,每次5 min。使用吸水紙吸除殘留載玻片PBS緩沖液后,加入3%過氧化物阻斷劑(Hydrogen Peroxide Block)50-100μl,阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶,室溫孵育10min。
10、PBS液中沖洗3min×3次;甩去PBS液,滴加強力阻斷劑5%牛血清,室溫孵育10min;用力輕甩去非免疫性牛血清封閉液,滴加一抗CD133或CD166(用PBS緩沖液代替一抗為陰性對照),放置于4℃冰箱過夜處理;PBS液中沖洗5min×3次;使用吸水紙吸除殘留載玻片上PBS緩沖液,滴加Super Enhancer液工作液,室溫孵育15-20min;在PBS液中沖洗3min×3次;滴加Polymer HRP試劑,室溫孵育30min; P
11、BS液中沖洗3min×3次;甩去PBS液,每張片滴加2滴新配制的DAB溶液(按說明書配制);3min后顯微鏡下觀察顯色情況,充分顯色后終止反應,流動自來水充分沖洗15min;蘇木素復染1min,酒精分化2秒鐘,流動自來水中沖洗10min以上,使用吹風機吹干;放入二甲苯透明,中性樹膠封片。
3.統(tǒng)計學分析
運用SPSS統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,實驗數(shù)據(jù)用中位數(shù)(Median,M)表示。根
12、據(jù)數(shù)據(jù)類型,性別、年齡、高低級別組腦膜瘤中CD133/CD166的IOD值比較采用兩獨立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗,部位間采用多個樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗。CD133與CD66的IOD值之間的相關性分析采用Spearman法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
結果:
1、CD133/CD166在腦膜瘤中的表達及分布形態(tài)多樣,基本形態(tài)主要如下:CD133陽性細胞形態(tài)有點狀陽性、
13、簇狀聚集陽性、血管周圍存在陽性;CD166陽性細胞形態(tài)有散在點狀陽性、簇狀聚集陽性;兩種抗體均表達于細胞膜及細胞質(zhì)。
2、CD133/CD166陽性表達在不同級別腦膜瘤組織的分布特征如下:CD133與CD166在不同級別的腦膜瘤均有表達;且CD133陽性細胞與CD166陽性細胞的分布有一定規(guī)律性,CD133及CD166陽性細胞表達水平隨腦膜瘤病理分級增高而增高,低級別組CD133及CD166陽性細胞較少,多散在分布,高級別
14、組CD133及CD166陽性細胞相對較多,更多標本中能夠觀察到陽性聚集分布,可見分布于血管壁的周圍,在CD133染色中,可見CD133陽性血管,這些CD133陽性細胞考慮為血管內(nèi)皮前體細胞,CD166染色為陰性。
3、不同級別組腦膜瘤中CD133陽性細胞與CD166陽性細胞IOD值;在不同級別組腦膜瘤中CD133陽性細胞IOD值分別為2466.59(高級別組)及578.56(低級別組),秩和檢驗兩組存在顯著性差異(Z=-4
15、.080,P=0.000);在不同級別組腦膜瘤中CD166陽性細胞IOD值分別為12919.51(高級別組)及4678.79(低級別組),秩和檢驗兩組存在顯著性差異(Z=-4.657,P=0.000)。
4、CD133與CD166表達的相關性及共定位表達情況,隨CD133表達升高CD166表達也有逐漸增高的趨勢。Spearman直線相關性檢驗顯示CD133與CD166在腦膜瘤組織中IOD值呈顯著正相關(R=0.706,P=
16、0.000)。鏡下觀察連續(xù)切片組織,可發(fā)現(xiàn)在相同區(qū)域的兩種抗體存在共定位表達的現(xiàn)象,周圍組織呈陰性表達,可作為內(nèi)對照區(qū)。
5、CD133、CD166與腦膜瘤預后的關系,統(tǒng)計高低級別組腦膜瘤的3年內(nèi)復發(fā)率,CD133弱表達組復發(fā)率為15.38%,強表達組復發(fā)率為28.57%,卡方檢驗二者無顯著性差異(p=0.16),提示CD133的表達量與腦膜瘤復發(fā)無明顯相關性。CD166弱表達組復發(fā)率為10.86%,強表達組復發(fā)率為32.
17、35%,二者存在顯著性差異(P=0.018)。CD166高表達組的復發(fā)率高于低表達組。
結論:
1、CD133與CD166在不同級別的腦膜瘤均有表達,CD133及CD166陽性細胞表達水平隨腦膜瘤病理級別增高而增高。并且在不同級別組腦膜瘤中CD133陽性細胞(p=0.001)與CD166陽性細胞(p=0.000) IOD值差異均有顯著性。
2、CD133及CD166表達成正相關關系。經(jīng)Spear
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