巨噬細(xì)胞固相色譜法的建立及其在蟲草免疫活性物質(zhì)研究中的應(yīng)用.pdf

1、中藥有幾千年的應(yīng)用歷史，臨床效果確切。然而長期以來，由于中藥的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)不明，臨床應(yīng)用多憑經(jīng)驗(yàn)，造成中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、作用機(jī)制研究、藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)研究等各項(xiàng)基礎(chǔ)研究變得十分困難，嚴(yán)重阻礙了中藥現(xiàn)代化。
　　 在效應(yīng)物質(zhì)的研究中，傳統(tǒng)方法是將中藥中的各種成分采用化學(xué)手段分離出來，然后逐一用動(dòng)物模型驗(yàn)證各個(gè)成分的效應(yīng)。這類方法步驟繁瑣、成本高、勞動(dòng)強(qiáng)度大且成功率不高。有鑒于此，人們發(fā)展了各種高通量研究方法.這些方法包括80年

2、代的利用受體分子、酶等分離篩選中藥中的活性成分；90年代的分子生物色譜法，采用將人血清白蛋白等固定在色譜擔(dān)體中，研究藥物分子與生物大分子的相互作用；其后出現(xiàn)細(xì)胞膜生物色譜法、模擬生物膜色譜法、細(xì)胞生物色譜法，等等。將受體分子保留在完整的細(xì)胞膜中有利于維持生物大分子的活性，這是對分子生物色譜法的改進(jìn)，由于在這些研究中，細(xì)胞膜或細(xì)胞仍然要固定在硅膠或凝膠顆粒中，因此也并非真正完整保持生物活性的細(xì)胞膜或活細(xì)胞。在這種情況下，我們發(fā)展了細(xì)胞(膜

3、)固相色譜法，同時(shí)滿足細(xì)胞(膜)的生物活性和色譜分離要求，用于研究中藥中的效應(yīng)物質(zhì)。
　　 本文第-部分第3點(diǎn)內(nèi)容，概述了本室這方面的研究工作情況。上述這些研究方法主要都是利用藥物分子與受體、酶等生物大分子的特異性親和作用來分離分析中藥中的效應(yīng)成分.由于受體等生物大分子的活性受環(huán)境的影響較大，因此越接近實(shí)際生理狀態(tài)的受體，其功能保存得越完全，在我們的研究中即在分析效應(yīng)成分的同時(shí)保證了細(xì)胞(膜)生存的環(huán)境。
　　 冬蟲夏草

4、是傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，蟲草菌粉是從天然蟲草中分離出蟲草真菌，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵得到菌絲體，再經(jīng)過焙干研粉而得到的菌粉。一般認(rèn)為，人工培養(yǎng)蟲草與天然蟲草的化學(xué)成分和藥理效應(yīng)相似，因此多將人工蟲草用作天然蟲草的代用品，用以緩解日漸緊張的天然蟲草資源。現(xiàn)代的臨床和藥理學(xué)研究表明蟲草具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠作用于免疫系統(tǒng)的多個(gè)方面。但是，在文獻(xiàn)報(bào)道中經(jīng)常出現(xiàn)研究結(jié)果不太一致的情況，這可能與蟲草來源、制備方法、動(dòng)物品系、模型生理病理狀態(tài)以及檢測手段不同

5、有關(guān)，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同，這使得蟲草的功效研究包括效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究陷入一定的困境。因此，如何采用既接近實(shí)際作用機(jī)制，又具有高效率的實(shí)驗(yàn)研究方法，是效應(yīng)物質(zhì)研究中亟待解決的問題。效應(yīng)成分通常是作用于細(xì)胞上的效應(yīng)靶點(diǎn)發(fā)揮作用的，蟲草的效應(yīng)，可能是通過作用于免疫細(xì)胞發(fā)揮作用的；在各種免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有吞噬、殺傷、遞呈抗原、分泌生物活性物質(zhì)、調(diào)控局部組織微環(huán)境等多種功能，是機(jī)體非特異防御的基礎(chǔ).巨噬細(xì)胞

6、不僅是先天性免疫中重要的細(xì)胞群，在特異性獲得性免疫中也發(fā)揮著重要作用，可以說，巨噬細(xì)胞幾乎影響著免疫系統(tǒng)的方方面面.同時(shí)，巨噬細(xì)胞價(jià)廉易得，因此我們免疫活性成分的固相色譜研究中選擇了巨噬細(xì)胞。由于蟲草對免疫系統(tǒng)具有多方面的影響，因此可能會(huì)與巨噬細(xì)胞發(fā)生作用，文獻(xiàn)中也常出現(xiàn)蟲草及其提取物影響巨噬細(xì)胞吞噬功能的報(bào)道。以現(xiàn)代藥理學(xué)理論推測，蟲草中的某些效應(yīng)成分能夠作用于巨噬細(xì)胞上的受體，從而發(fā)揮效應(yīng)，影響巨噬細(xì)胞的功能活動(dòng)。我們可以利用效應(yīng)成

7、分與巨噬細(xì)胞的這種結(jié)合作用，將它們從中藥提取物中分離出來，并結(jié)合一定的檢測和鑒定方法，明確這些成分.這是本論文第一部分中所闡述的假說形成過程。
　　 第二部分內(nèi)容重點(diǎn)講述巨噬細(xì)胞固相色譜的研究過程，是整部論文的核心.第二部分第一章中的內(nèi)容主要是采用RP-HPLC法，研究了十種蟲草樣品水提液的成分譜，確定了檢測波長260 nm、檢測時(shí)間30 min，優(yōu)化了其他色譜分析條件，考察了儀器分析的精密度。在確定的檢測方法下分析了蟲草樣品液

8、的成分譜，為下面進(jìn)一步研究其中的效應(yīng)成分打下基礎(chǔ).在這些成分中，多數(shù)是核苷類成分，不同的蟲草樣品核苷的種類和含量是有差異的，根據(jù)比較分析，綜合考慮，我們選擇江西國藥的蟲草菌粉作為下一步研究的工具藥。第二章里探討了巨噬細(xì)胞分離效應(yīng)成分的可能性，建立巨噬細(xì)胞固相色譜法，研究免疫相關(guān)活性成分。研究采用蟲草提取液，觀察了其中幾種主要的核苷類成分與巨噬細(xì)胞的作用情況，發(fā)現(xiàn)兩種核苷可以被巨噬細(xì)胞明顯“固定”。在成分鑒定中，我們采用光譜掃描、標(biāo)準(zhǔn)品加

9、樣對照、質(zhì)譜分析，并結(jié)合文獻(xiàn)研究，確定這兩個(gè)成分是腺苷和鳥苷。腺苷是藥典中蟲草含量測定的指標(biāo)性成分，而鳥苷不是，因此本方法在探索效應(yīng)成分，完善中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面體現(xiàn)了應(yīng)用前景。為了進(jìn)一步明確這種結(jié)合作用，同時(shí)避免中藥提取物中無關(guān)成分的干擾，我們采用了核苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；為了研究不同種屬的巨噬細(xì)胞，我們還進(jìn)行了小鼠巨噬細(xì)胞的“固相”研究，結(jié)果顯示：標(biāo)準(zhǔn)品與蟲草樣品溶液中的相應(yīng)核苷類成分均能與巨噬細(xì)胞發(fā)生，大鼠和小鼠的巨噬細(xì)胞研究結(jié)果也相似。

10、被結(jié)合成分的效應(yīng)如何將在后面的效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中加以驗(yàn)證，為了排除生物膜的非特異性吸附作用，第三章里我們選擇SMMC-7721人肝癌細(xì)胞株、熱處理巨噬細(xì)胞、紫外線照射細(xì)胞以及拮抗劑茶堿作用后的細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合作用研究。研究結(jié)果表明：相關(guān)核苷類成分在所考察時(shí)間內(nèi)不與SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生明顯結(jié)合作用，這可能是與細(xì)胞受體種類不同有關(guān)；這些核苷類成分也不與或極少與熱處理巨噬細(xì)胞和紫外線照射細(xì)胞發(fā)生結(jié)合作用，這可能與細(xì)胞受損后受體活性降低有關(guān)，而腺苷受

11、體拮抗劑茶堿可以很明顯的拮抗蟲草中腺苷的結(jié)合作用。第四章，我們研究了前述被巨噬細(xì)胞“固定化”的成分對巨噬細(xì)胞功能的影響。巨噬細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子的改變也能夠反映巨噬細(xì)胞功能活動(dòng)的變化，因此在本章第一節(jié)中我們采用ELISA方法檢測TNF-α、IL-1β，采用Griess法檢測NO等方法，觀察“固定”核苷成分與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后對巨噬細(xì)胞功能活動(dòng)的影響。由于天然蟲草與人工蟲草的含量差異，因此我們同時(shí)評價(jià)了不同比例核苷的效應(yīng)，

12、結(jié)果腺苷和鳥苷更多的表現(xiàn)出來的是對巨噬細(xì)胞的抑制效應(yīng)，而尿苷有輕微的激活效應(yīng)；還證明了核苷類成分即便種類相同，如果含量比例不同，對細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生不同的作用。第四章第二節(jié)觀察了腺苷、鳥苷和尿苷對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響，結(jié)果腺苷和鳥苷仍然表現(xiàn)抑制作用而尿苷有輕微促進(jìn)作用，
　　 第三部分對本研究的思路形成過程、假說的提出和論證過程進(jìn)行了討論，對下一步工作進(jìn)行了展望，并涉及關(guān)于現(xiàn)有方法的一些存在問題。同時(shí)，對于如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞固相過程與儀器