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文檔簡介
1、目前,外源基因表達(dá)載體多以抗生素抗性基因作為選擇標(biāo)記,對于基因治療和基因免疫用表達(dá)載體,這些抗性標(biāo)記基因的存在有可能引起一系列生物安全性問題。因此,需用更為安全的非抗生素抗性標(biāo)記表達(dá)載體,其中染色體.質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)具有廣泛的應(yīng)用前景。 為了構(gòu)建用于動(dòng)物基因治療和基因免疫的非抗性標(biāo)記表達(dá)載體,我們將DH5a大腸桿菌在含有胸腺嘧啶核苷和3-甲氧2-氨嘧啶的CBT培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng),篩選得ThyA-突變株21株。這些突變株在不含胸
2、腺嘧啶核苷的CB瓊脂平板上不生長,只有在添加胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基或轉(zhuǎn)化thyA表達(dá)載體后才能在正常培養(yǎng)基生長。為了研究thyA基因突變的分子機(jī)理,用高保真PCR法克隆4個(gè)突變株的thyA基因,序列分析結(jié)果顯示,4、7、13號(hào)菌株在70位堿基起有6個(gè)堿基缺失,導(dǎo)致25位甘氨酸和26位蘇氨酸的缺失;6號(hào)突變株在92位堿基由G突變?yōu)锳,導(dǎo)致31位甘氨酸被天冬氨酸替換。用PCR克隆野生大腸桿菌的ThyA基因,將其克隆入原核表達(dá)載體,用重組大腸桿
3、菌表達(dá)的重組蛋白免疫小鼠,用獲得的抗血清進(jìn)行免疫轉(zhuǎn)印試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株的ThyA基因仍能表達(dá)。 根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌菌株thyA基因序列設(shè)計(jì)一對引物,用PCR擴(kuò)增包括啟動(dòng)子的thyA基因,將序列正確的基因取代表達(dá)人溶菌酶基因的真核載體pcDNAKYZ中的卡那抗性基因,獲得非抗性選擇標(biāo)記表達(dá)載體pDTALYZ。將其轉(zhuǎn)化ThyADH5a大腸桿菌,轉(zhuǎn)化菌涂布不含胸腺嘧啶核苷的CB平板,篩選得非抗性標(biāo)記重組大腸桿菌。在CBt液體培養(yǎng)基傳
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