人體RNA解旋酶A(RHA)與依諾沙星對(duì)RNA干擾的共增強(qiáng)效應(yīng)研究.pdf

1、RNA干擾目前已經(jīng)成為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中研究特定基因功能的主流分子生物學(xué)手段。大規(guī)模的基于RNA干擾的分析方法受到脫靶效應(yīng)以及干擾素響應(yīng)等現(xiàn)象的影響，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，這主要是由使用高濃度的siRNA所導(dǎo)致。但在RNA干擾實(shí)驗(yàn)中，降低siRNA的濃度會(huì)伴隨著基因沉默效率的降低。所以如何尋求適當(dāng)?shù)膕iRNA的使用量并得到真實(shí)的干擾效果，成為了使用RNA干擾技術(shù)的重要問(wèn)題。本文正是著眼于RNA干擾機(jī)制中這樣的現(xiàn)狀，提出影響RNA干擾效率的一個(gè)重要

2、因素是雙鏈siRNA的穩(wěn)定性。我們猜測(cè)：RNA解旋酶的抑制劑可以通過(guò)抑制RNA干擾途徑中的解旋酶家族蛋白，從而增強(qiáng)雙鏈siRNA的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA干擾效果的增強(qiáng)。
　　 氟化喹諾酮類化合物因?yàn)榫哂幸种萍?xì)菌Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶(例如：革蘭氏陰性細(xì)菌中的DNA解旋酶以及革蘭氏陽(yáng)性菌中的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ)活性而被作為廣譜抗生素使用。本實(shí)驗(yàn)室張強(qiáng)哲和張彩紅老師已經(jīng)得到依諾沙星對(duì)RNA干擾有增強(qiáng)效應(yīng)的結(jié)論。在此基礎(chǔ)上，我的工作主要有以下三

3、個(gè)部分：
　　 一、對(duì)于依諾沙星增強(qiáng)RNA干擾的靶標(biāo)做出了進(jìn)一步的猜測(cè)和論證：通過(guò)在HEK293A細(xì)胞體系中過(guò)量表達(dá)人體RNA解旋酶A(RHA)，得到RHA與依諾沙星對(duì)于RNA干擾的共激活效應(yīng)，并且這種效應(yīng)也是具有濃度依賴性的。這為探尋依諾沙星增強(qiáng)RNA干擾效應(yīng)的靶標(biāo)提供了證據(jù)；
　　 二、將人體RNA解旋酶A按照功能結(jié)構(gòu)域分別構(gòu)建在真核表達(dá)載體中，在HEK293A細(xì)胞體系中驗(yàn)證不同結(jié)構(gòu)域的過(guò)量表達(dá)與依諾沙星對(duì)于RNA干

4、擾的協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：不同功能結(jié)構(gòu)域與依諾沙星的協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)不如RHA全酶的增強(qiáng)效應(yīng)明顯，但是個(gè)別結(jié)構(gòu)域(如：RGG box)對(duì)RNA干擾有增強(qiáng)效應(yīng)。這為我們進(jìn)一步探索RNA干擾途徑中人體RNA解旋酶A(RHA)的功能提供了手段；
　　 三、人體RNA解旋酶A(RHA)的原核表達(dá)純化：通過(guò)對(duì)不同原核表達(dá)載體和菌株的選擇和嘗試，我們得到了以包涵體表達(dá)的全長(zhǎng)人體RNA解旋酶A。并嘗試了初步的變性純化和復(fù)性手段，但是遺憾的是