人體RNA解旋酶A(RHA)與依諾沙星對RNA干擾的共增強效應研究.pdf

1、RNA干擾目前已經(jīng)成為哺乳動物細胞中研究特定基因功能的主流分子生物學手段。大規(guī)模的基于RNA干擾的分析方法受到脫靶效應以及干擾素響應等現(xiàn)象的影響，產(chǎn)生假陽性結(jié)果，這主要是由使用高濃度的siRNA所導致。但在RNA干擾實驗中，降低siRNA的濃度會伴隨著基因沉默效率的降低。所以如何尋求適當?shù)膕iRNA的使用量并得到真實的干擾效果，成為了使用RNA干擾技術的重要問題。本文正是著眼于RNA干擾機制中這樣的現(xiàn)狀，提出影響RNA干擾效率的一個重要

2、因素是雙鏈siRNA的穩(wěn)定性。我們猜測：RNA解旋酶的抑制劑可以通過抑制RNA干擾途徑中的解旋酶家族蛋白，從而增強雙鏈siRNA的穩(wěn)定性，實現(xiàn)對RNA干擾效果的增強。
　　 氟化喹諾酮類化合物因為具有抑制細菌Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶(例如：革蘭氏陰性細菌中的DNA解旋酶以及革蘭氏陽性菌中的DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅳ)活性而被作為廣譜抗生素使用。本實驗室張強哲和張彩紅老師已經(jīng)得到依諾沙星對RNA干擾有增強效應的結(jié)論。在此基礎上，我的工作主要有以下三

3、個部分：
　　 一、對于依諾沙星增強RNA干擾的靶標做出了進一步的猜測和論證：通過在HEK293A細胞體系中過量表達人體RNA解旋酶A(RHA)，得到RHA與依諾沙星對于RNA干擾的共激活效應，并且這種效應也是具有濃度依賴性的。這為探尋依諾沙星增強RNA干擾效應的靶標提供了證據(jù)；
　　 二、將人體RNA解旋酶A按照功能結(jié)構(gòu)域分別構(gòu)建在真核表達載體中，在HEK293A細胞體系中驗證不同結(jié)構(gòu)域的過量表達與依諾沙星對于RNA干

4、擾的協(xié)同增強效應。實驗結(jié)果顯示：不同功能結(jié)構(gòu)域與依諾沙星的協(xié)同增強效應不如RHA全酶的增強效應明顯，但是個別結(jié)構(gòu)域(如：RGG box)對RNA干擾有增強效應。這為我們進一步探索RNA干擾途徑中人體RNA解旋酶A(RHA)的功能提供了手段；
　　 三、人體RNA解旋酶A(RHA)的原核表達純化：通過對不同原核表達載體和菌株的選擇和嘗試，我們得到了以包涵體表達的全長人體RNA解旋酶A。并嘗試了初步的變性純化和復性手段，但是遺憾的是