RNA干擾樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)狼瘡腎炎小鼠的治療研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一累及全身多系統(tǒng)，多器官的自身免疫性性疾病，狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是SLE最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)之一，是一種免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎小球疾病。狼瘡性腎炎的治療近年已取得了很大進(jìn)展，糖皮質(zhì)激素和/或免疫抑制劑及細(xì)胞毒性藥物仍是LN治療的首選藥物。然而還有很多問(wèn)題沒(méi)有解決，終末期腎功能衰竭仍是LN死亡的主要原因之一。另外糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑及細(xì)胞毒性藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用引起的毒副作用尚有待解決。因此有必

2、要尋求一種新的治療途徑。
　　 大量的研究表明在SLE患者體內(nèi)無(wú)論是B細(xì)胞異常引起的體液免疫反應(yīng)還是T細(xì)胞異常引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)都與樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的功能改變有直接關(guān)系。
　　 DC是一種已知功能最強(qiáng)的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞，研究表明DC是免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的核心細(xì)胞，除了具有免疫激發(fā)功能外，在誘導(dǎo)中樞免疫耐受以及外周免疫耐受的維持和調(diào)節(jié)也發(fā)揮重要作用。研究認(rèn)為DC的來(lái)源、表型、成熟度和功能的異質(zhì)性是

3、平衡免疫反應(yīng)和免疫耐受的重要因素。
　　 輔助性T細(xì)胞(Th)可分為T(mén)h1和Th2細(xì)胞，生理?xiàng)l件下，機(jī)體的Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞處于相對(duì)平衡狀態(tài)，一旦這種平衡發(fā)生平衡發(fā)生偏離，機(jī)體就會(huì)處于疾病狀態(tài)。最近的研究表明，Th1/Th2細(xì)胞的平衡偏離及細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)異常與SLE的發(fā)病及病理?yè)p傷密切相關(guān)。研究認(rèn)為輔助性T細(xì)胞的分化主要受DC所調(diào)控。DC通過(guò)其表面分子刺激T細(xì)胞活化，通過(guò)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)Th細(xì)胞分化方向。通過(guò)調(diào)控DC的成熟，進(jìn)

4、而調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞分化過(guò)程和影響它們的效應(yīng)機(jī)制是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和免疫耐受的關(guān)鍵。
　　 核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)是已知的在炎癥和免疫中發(fā)揮核心作用的轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為是DC發(fā)育成熟的關(guān)鍵性調(diào)控基因，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)有五種NF-κB/REL成員。人類(lèi)嘗試?yán)肦NAi技術(shù)減弱NF-κB表達(dá)及活性，以期獲得致耐受DC。RelB作為NF-KB家族的五個(gè)成員之一，是小鼠骨髓DC發(fā)育成熟所必需的，因而RelB不失為RNAi作用的一個(gè)很好靶

5、標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)擬采用利用RNA干擾抑制RELB基因表達(dá)來(lái)構(gòu)建耐受性DC應(yīng)用于治療狼瘡腎炎小鼠。
　　 目的：
　　 1.RNA干擾樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的免疫耐受作用及機(jī)制。
　　 2.觀察RNA干擾樹(shù)突狀細(xì)胞成熟對(duì)狼瘡腎炎小鼠的治療效應(yīng)，為L(zhǎng)N治療提供新的思路與依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 體外培養(yǎng)小鼠骨髓來(lái)源DC細(xì)胞，于收集前24小時(shí)加入LPS(1ug/ml)可得到成熟DC即mDC.收集mDC用Lip

6、ofectamine2000介導(dǎo)RNA干擾，實(shí)驗(yàn)分為5組：第1組RNAi的陽(yáng)性對(duì)照；第2組RNAi的陰性對(duì)照；第3、4、5組分別加入siRNA序列1、siRNA序列2、siRNA序列3。通過(guò)半定量RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中relB的mRNA含量，Western Blot檢測(cè)relB蛋白含量。篩選出阻斷relB效果最明顯的siRNA序列，然后轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的mDC。與未轉(zhuǎn)染組做對(duì)照。光鏡電鏡檢測(cè)DC形態(tài)檢測(cè);流式細(xì)胞檢測(cè)DC表面標(biāo)志(MHC

7、Ⅱ、CD80、CD86)；ELISA檢測(cè)DC分泌細(xì)胞因子(IL-12)的改變。
　　 同時(shí)制造狼瘡腎炎模型.通過(guò)檢測(cè)血清抗ds-DNA抗體，尿蛋白檢測(cè)，腎組織光電鏡觀察進(jìn)行鑒定.
　　 將干擾后的樹(shù)突狀細(xì)胞輸入狼瘡腎炎動(dòng)物模型中，模型鼠分為3組：空白對(duì)照組(尾靜脈注射生理鹽水)，非干預(yù)組(尾靜脈注射未處理DC)，干預(yù)組(尾靜脈注射干擾后DC).檢測(cè)各組蛋白尿水平、血清抗ds-DNA抗體及腎組織病理改變。
　　 結(jié)

8、果:
　　 小鼠骨髓細(xì)胞在rmGM-CSF和rmIL-4刺激下培養(yǎng)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞集落明顯增多，到5-7天，可見(jiàn)大量細(xì)胞懸浮.經(jīng)流式檢測(cè)CD11c陽(yáng)性率比較高.3個(gè)序列siRNA干擾mDC后其中有序列3 siRNA能明顯沉默RelB基因。特異位點(diǎn)的RelB siRNA干擾后DC形態(tài)近似未成熟DC，MHCⅡ、CD80，CD86水平及細(xì)胞因子(IL-12)的分泌顯著低于未干擾組.
　　 模型鼠自第4周開(kāi)始出現(xiàn)尿蛋白升高

9、，抗ds-DNA抗體陽(yáng)性，腎臟病理表現(xiàn)為腎小球彌漫增生，炎癥細(xì)胞增多。
　　 siRNA干擾后的耐受性DC輸入模型鼠體內(nèi)后3周尿蛋白排泄減少，抗ds-DNA抗體水平下降，腎臟病理改變減輕。
　　 結(jié)論:
　　 1.特異位點(diǎn)的RelB siRNA對(duì)小鼠骨髓來(lái)源DC有抑制成熟作用：
　　 (1)siRNA干擾后DC形態(tài)近似未成熟DC，樹(shù)突減少；
　　 (2)降低細(xì)胞表面MHCⅡ、CD80、CD86水平

10、；
　　 (3)抑制DC分泌IL-12。
　　 2.淋巴細(xì)胞輸入能誘導(dǎo)小鼠狼瘡腎炎樣模型：
　　 (1)模型鼠表現(xiàn)為類(lèi)似狼瘡腎炎樣癥狀如脫毛，腹水，消瘦;
　　 (2)模型鼠尿蛋白水平顯著增高；
　　 (3)抗ds-DNA抗體陽(yáng)性；
　　 (4)腎臟病理表現(xiàn)為腎小球彌漫增生，炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)。
　　 3.siRNA干擾后的耐受性DC對(duì)模型鼠有一定的治療作用：
　　 (1)耐受性