RNA干擾抑制登革病毒復(fù)制的研究.pdf

1、登革熱(dengue fever,DF)是由登革病毒引起的蟲媒病毒性傳染病，主要通a過埃及伊蚊(αedes αegypti)和白紋伊蚊(αedes αlbopictus)傳播，登革出血熱(dengue hemorrhagic fever,DHF)則是登革熱的一種嚴(yán)重類型，伴有休克癥狀的登革出血熱稱為登革休克綜合征(dengue shock syndrome，DSS)。本病廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是世界上分布最廣、發(fā)病人數(shù)最多、危害最

2、大的一種蟲媒病毒性疾病，已經(jīng)成為一個世界性的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。
　　 我國登革熱的首次流行發(fā)生于1873年福建省廈門市，建國后的首次暴發(fā)流行發(fā)生于1978年廣東省佛山市，自1978年以來我國已發(fā)生14次登革熱暴發(fā)流行或局部流行，以廣東、海南、福建等東南沿海地區(qū)為主，登革熱也已經(jīng)成為我國的一個嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。
　　 登革病毒(dengue virus，DENV)屬于黃病毒科，分為Ⅰ～Ⅳ型四個血清型。DENV是正鏈RNA病

3、毒，大小約為11kb，編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白。目前，登革熱的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，也沒有有效的疫苗或治療藥物。新近的研究表明，RNA干擾技術(shù)可能成為治療登革病毒感染的新的突破口。
　　 RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象是一種由雙鏈RNA(double-strandRNA，dsRNA)啟動的序列特異性基因沉默機(jī)制，由Andrew Z.Fire于1998年首先發(fā)現(xiàn)并命名。RNAi從線蟲到人類細(xì)胞中都

4、廣泛存在，是自然界中生物抵抗外源基因或病毒入侵的一種防御方式。
　　 近年來，RNAi方面的研究取得了很大進(jìn)展，2000-2002年連續(xù)3年被《Science》雜志列入年度世界十大科學(xué)突破。RNAi技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于病毒防治、基因功能研究、腫瘤基因治療、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種領(lǐng)域，充分顯示了其巨大的應(yīng)用潛力。作為宿主細(xì)胞抑制病毒復(fù)制、清除病毒的一種胞內(nèi)機(jī)制，RNAi已被證明可應(yīng)用于HIV、HBV以及SARS冠狀病毒等多種抗病毒感染研究領(lǐng)

5、域。
　　 慢病毒(Lentivirus)是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)，作為一種新型的基因治療載體，已廣泛應(yīng)用于多種基因功能的研究中。慢病毒能感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，且慢病毒在感染細(xì)胞后能整合到受感染細(xì)胞的基因組中，隨著細(xì)胞的生長而長時間穩(wěn)定表達(dá)目的基因，因此不需要反復(fù)感染，效果持久。慢病毒介導(dǎo)的RNAi具有高效、持久、穩(wěn)定的特點(diǎn)，是攜帶干擾RNA的理想載體。
　　 目前，由慢病毒介導(dǎo)的RNAi抑制登革

6、病毒復(fù)制的研究尚未見文獻(xiàn)報道，因此，本研究擬針對Ⅰ型登革病毒設(shè)計特定序列的siRNA(small interfering RNA)，在白蚊伊蚊C6/36細(xì)胞中篩選可高效抑制登革病毒復(fù)制的siRNA序列；再將該序列重組到慢病毒載體中，構(gòu)建長效表達(dá)siRNA慢病毒載體，包裝慢病毒，并將其導(dǎo)入C6/36細(xì)胞中，為下一步研究RNAi長效抑制登革病毒的復(fù)制奠定基礎(chǔ)，為登革熱的疫苗研制和臨床基因治療提供依據(jù)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果：
　　 第一

7、部分高效抑制登革病毒在蚊細(xì)胞中復(fù)制的siRNA序列篩選
　　 1.Ⅰ型登革病毒的擴(kuò)增與定量病毒毒株采用廣州市2002年Ⅰ型登革病毒流行株GZ02-218，感染C3/36細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，細(xì)胞病變達(dá)到++時收獲病毒，TCID50測定病毒滴度，結(jié)果測得病毒TCID50為10-3.5/0.1ml。
　　 2.siRNA序列的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中廣州市2002年Ⅰ型登革病毒流行株GZ02-218、Ⅰ型登革病毒參考株及其

8、它Ⅰ型登革病毒基因序列，針對病毒基因組不同位置設(shè)計了10段siRNA序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析，選擇合成其中4段siRNA(DenSi-1～4)。
　　 3.有效siRNA序列的初步篩選采用脂質(zhì)體法將合成的4段siRNA序列轉(zhuǎn)染到C6/36細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6小時后用登革病毒攻擊。病毒攻擊5～7天后，根據(jù)各組細(xì)胞病變情況，初步確定siRNA片段DenSi-2～4無效，片段DenSi-1有效，可進(jìn)一步探討其干擾作用。
　　 4.si

9、RNA對登革病毒干擾作用的探討：
　　 (1)siRNA穩(wěn)定性用標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)的siRNA轉(zhuǎn)染C6/36細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測得轉(zhuǎn)染后6h及第1、3、5、7天含有熒光的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比分別為66.0％、52.1％、32.0％、13.5％、8.9％。
　　 (2)實驗分組C6/36細(xì)胞分為以下四個組：正常組：無siRNA轉(zhuǎn)染、病毒感染；siRNA組：轉(zhuǎn)染siRNA后用病毒感染攻擊；轉(zhuǎn)染對照組：轉(zhuǎn)染21nt的對照siR

10、NA序列后用病毒感染攻擊；病毒陽性對照組：不轉(zhuǎn)染siRNA，直接用病毒感染攻擊。
　　 (3)siRNA對受登革病毒攻擊的C6/36細(xì)胞形態(tài)的影響登革病毒攻擊7天后，觀察各組細(xì)胞形態(tài)，可見：正常組細(xì)胞無病變；病毒陽性對照組和轉(zhuǎn)染對照組出現(xiàn)大量細(xì)胞病變，細(xì)胞腫脹并成片融合達(dá)到++++，細(xì)胞數(shù)目明顯減少；siRNA組細(xì)胞無病變，細(xì)胞數(shù)目無明顯減少。
　　 (4)MTT法檢測C6/36細(xì)胞存活率結(jié)果登革病毒攻擊7天后，MTT法

11、測得各組細(xì)胞存活率為：siRNA組76.9％±4.5％，轉(zhuǎn)染對照組43.9％±3.6％，病毒陽性對照組23.6％±14.6％。siRNA組與病毒陽性對照組相比具有顯著性差異，細(xì)胞存活率增加2.26倍(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染對照組與病毒陽性對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 (5)siRNA對C6/36細(xì)胞內(nèi)登革病毒RNA含量的影響登革病毒攻擊7天后，用熒光定量PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)登革病毒核酸量，正常組未檢測到病毒核酸，s

12、iRNA組CT值為19.9140.63，轉(zhuǎn)染對照組CT值為14.63±0.91，病毒陽性對照組CT值為14.56±0.39。siRNA組與病毒陽性對照組相比△CT值為5.34，其病毒核酸量僅為病毒陽性對照組的1/25.34，約1/40，siRNA對C6/36細(xì)胞內(nèi)登革病毒復(fù)制的抑制率達(dá)到97.54％，具有顯著性差異(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染對照組與病毒陽性對照組相比△CT值為0.07，無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 第二部分s

13、iRNA慢病毒載體的構(gòu)建、包裝及鑒定
　　 1.慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　 (1)根據(jù)第一部分篩選得到的有效siRNA片段設(shè)計合成一對DNAoligo序列，經(jīng)退火形成雙鏈后，在T4鏈接酶作用下，與線性化的表達(dá)質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR進(jìn)行鏈接反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)抗性基因(Blasticidin)篩選得到的陽性克隆，通過測序驗證完全正確，表明重組質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmG

14、FPmiR-SR42構(gòu)建成功，大量擴(kuò)增質(zhì)粒備用。
　　 (2)采用Gateway重組技術(shù)構(gòu)建重組慢病毒載體：將重組質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-SR42與質(zhì)粒pDONRTM221和pLenti6/V5-DEST進(jìn)行快速BP/LR重組反應(yīng)，得到重組慢病毒載體pLenti6/V5-DEST-SR42，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞OneShotStb13，經(jīng)抗性基因(Amplicillin)篩選得到的陽性克隆，通過測序驗證完

15、全正確，表明重組慢病毒載體構(gòu)建成功，大量擴(kuò)增質(zhì)粒備用。
　　 2.慢病毒包裝與滴度測定用LipofectamineTM2000將重組慢病毒載體pLenti6/V5-DEST-SR42，與包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后收集病毒上清液，經(jīng)純化后感染293FT細(xì)胞進(jìn)行病毒滴度測定，測得的病毒滴度為：7.5*107TU/ml。
　　 3.慢病毒感染293T細(xì)胞，檢測miRNA的表達(dá)

16、。
　　 慢病毒以MOI=5感染293FT細(xì)胞，72小時后收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增目的序列，擴(kuò)增產(chǎn)物測序驗證miRNA的表達(dá)。測序結(jié)果經(jīng)序列對比完全正確，表明重組慢病毒能夠在靶細(xì)胞中表達(dá)目的基因。
　　 4.慢病毒感染C6/36細(xì)胞慢病毒以MOI=10感染C6/36細(xì)胞，72小時后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況?？梢娐《窘M細(xì)胞內(nèi)有較多綠色熒光，而空白對照組無熒光表達(dá)，表明慢病毒成功轉(zhuǎn)染至

17、C6/36細(xì)胞中。
　　 結(jié)論及研究意義：
　　 1.獲得了一段長為21nt的siRNA序列，證實了其能夠有效抑制登革病毒在蚊細(xì)胞中的復(fù)制。siRNA轉(zhuǎn)染C6/36細(xì)胞后，能增加細(xì)胞存活率，并減少病毒載量。
　　 2.成功構(gòu)建了表達(dá)siRNA的慢病毒載體，并將其成功轉(zhuǎn)染至C6/36細(xì)胞中，驗證了其在靶細(xì)胞C6/36細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 3.為下一步研究RNAi長效抑制登革病毒的復(fù)制奠定了基礎(chǔ)，為登革熱的疫