SARS病毒RdRp基因的RNA干擾研究.pdf

1、本研究選擇SARS病毒的RdRp基因?yàn)镽NAi的靶基因。我們首先設(shè)計(jì)了1種安全、高效而可靠的方法來(lái)合成該基因：根據(jù)DNA shuffling技術(shù)的原理和SARS病毒RdRp基因的序列，設(shè)計(jì)并合成了多條寡核苷酸片段，每個(gè)片段末端都兩兩互補(bǔ)，從而在PCR過(guò)程中相互延伸，最終精確地組裝成RdRp基因。所得基因的序列與預(yù)期設(shè)計(jì)完全吻合。 利用pcDNA3.1(+)和pEGFP-C1載體構(gòu)建了3類真核重組表達(dá)質(zhì)粒，并以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白作

2、為標(biāo)記基因。構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒包括：1)分別表達(dá)RdRp和EGFP基因的質(zhì)粒：pcDNA-RdRp和pcDNA-EGFP 。轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞后，pcDNA-G可表達(dá)明顯的綠色熒光蛋白；2)表達(dá)RdRp和EGFP融合基因的質(zhì)粒：pcDNA-GR和pcDNA-RG，pEGFP-CRl和pEGFP-CR2。轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞后，前2個(gè)質(zhì)粒表達(dá)的蛋白質(zhì)熒光較弱；后2個(gè)熒光很強(qiáng)，可用于瞬時(shí)表達(dá)研究；3)雙順?lè)醋颖磉_(dá)質(zhì)粒：以pcDNA3.1(

3、+)為骨架，引入IRES元件，構(gòu)建了pcDNA-GIR和pcDNA-RIG。pcDNA-GIR在細(xì)胞中的熒光蛋白表達(dá)量較強(qiáng)，還可以整合到宿主細(xì)胞的基因組中用于建立穩(wěn)定的細(xì)胞株；pcDNA-RIG在細(xì)胞中的熒光蛋白表達(dá)非常弱。 對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1)本研究中的最佳轉(zhuǎn)染條件為：2μg超螺旋狀態(tài)的無(wú)內(nèi)毒素型超純質(zhì)粒DNA，DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例為1:5，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度為60-80％，DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物與細(xì)胞共

4、同孵育的時(shí)間為2-4 h；2)幾種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別為：HEK293：85-90％；COS-7：75-80％；Hela：75-80％；Vero E6：10-15％；3)細(xì)胞株對(duì)G418的敏感性為：轉(zhuǎn)染后最初的篩選，Vero E6、HEK293和COS-7使用800 mg/L的G418，Hela細(xì)胞為900 mg／L；對(duì)于篩選出來(lái)的穩(wěn)定細(xì)胞株，Hela細(xì)胞用300 mg／L、其余3種用200 mg/L的G418來(lái)維持抗性。探索出通過(guò)手工分

5、選來(lái)建立細(xì)胞株的方法，并分別建立了Vero-EGFP、Vero-RdRp、Vero-GIR和293-GIR等4種細(xì)胞株。Vero-RdRp能單獨(dú)表達(dá)RdRp，可用于SARS病毒RdRp的真核細(xì)胞表達(dá)、純化和性質(zhì)等的研究；Vero-EGFP可以為RNAi研究或轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)提供對(duì)照；Vero-GIR和293-GIR可用于研究siRNA對(duì)內(nèi)源基因的干擾作用。 在上述所有結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了RdRp基因的RNAi研究。1)用體外轉(zhuǎn)錄法合成

6、siRNA，分別和質(zhì)粒pEGFP-CRl共轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞，利用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)法、熒光定量RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，各組siRNA的抑制效率分別為：siRl和siR2為85-90％，siR3和siR4為70-75％，sirl+siR2為95％，siGFP為80％，siNC為3％。2)用人U6啟動(dòng)子構(gòu)建了siRl、siR2和siGFP的siRNA表達(dá)盒，將它們和pEGFP-CRl共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，4

7、8 h后的熒光顯微鏡觀察和分析表明，SEC有著明顯的抑制靶基因表達(dá)的作用，其效率和相應(yīng)的siRNA一致。3)將siRl和siR2與pEGFP-CRl質(zhì)粒以尾靜脈高壓注射法導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，用定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了48 h后幾個(gè)重要器官中RdRp基因的表達(dá)，結(jié)果表明，siRNA在體內(nèi)有著和細(xì)胞中相似的RNAi效果，而且同一種siRNA在不同的器官中作用效果一致。上述RNAi研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，對(duì)SARS病毒RdRp基因的2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行干擾，可

8、以獲得80-90％的抑制效率；同時(shí)干擾這2個(gè)位點(diǎn)，其抑制效率可進(jìn)一步增加，達(dá)到95％左右。 本研究首先通過(guò)3套方案的探索和改進(jìn)，最終建立了1種優(yōu)化的組裝基因的方法，用合成的寡核苷酸片段在無(wú)病毒的體系中組裝出完整的RdRp基因。隨后，將組裝的RdRp片段克隆到質(zhì)粒pcDNA-3.1(+)中，獲得真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-RdRp，再經(jīng)測(cè)序證實(shí)，所獲得的RdRp基因與預(yù)期設(shè)計(jì)完全吻合，并與99株SARS病毒基因組中的相應(yīng)序列10

9、0％同源，表明該片段是最理想的RNAi靶序列。 本研究利用pcDNA3.1(+)和pEGFP-C1載體共構(gòu)建了3類真核重組表達(dá)質(zhì)粒：1、分別表達(dá)RdRp基因和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒：pcDNA．RdRp和pcDNA-EGFP(pcDNA-G)。轉(zhuǎn)染vero E6細(xì)胞后，經(jīng)倒置熒光顯微鏡觀察，pcDNA-G可表達(dá)非常明顯的綠色熒光蛋白，pcDNA-R無(wú)熒光；2、表達(dá)RdRp和EGFP融合基因的質(zhì)粒：pcDNA-GR和pcDNA

10、-RG，pEGFP-CRI和pEGFP-CR2。轉(zhuǎn)染Veto E6細(xì)胞后，前2個(gè)質(zhì)粒表達(dá)的綠色熒光蛋白均較弱，后2個(gè)質(zhì)粒在Vero E6細(xì)胞中表達(dá)的綠色熒光蛋白均很強(qiáng)，但它們無(wú)法整合到宿主細(xì)胞的基因組中，可用于瞬時(shí)表達(dá)的研究；3、雙順?lè)醋颖磉_(dá)質(zhì)粒：以pcDNA3.1(+)為骨架，引入質(zhì)粒plRESneo中的IRES元件，構(gòu)建了pcDNA-GIR和IpcDNA-RIG。其中pcDNA-GIR在細(xì)胞中的熒光蛋白表達(dá)量較強(qiáng)，載體也可以整合到宿

11、主細(xì)胞的基因組中用于建立穩(wěn)定的細(xì)胞株，而pcDNA-RIG在細(xì)胞中的熒光蛋白表達(dá)非常弱。 限制酶切和PCR鑒定以及測(cè)序分析均表明，上述各個(gè)質(zhì)粒與預(yù)期結(jié)果相符；各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞后，均能轉(zhuǎn)錄出預(yù)期大小的mRNA;經(jīng)倒置熒光顯微鏡觀察，各個(gè)質(zhì)粒在Vero E6細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白的強(qiáng)度由大到小為：pcDNA-G，pEGFP-CRI和pEGFP-CR2，pcDNA-GIR，pcDNA-GR，pcDNA-RG，pcDNA-R

12、IG。后3個(gè)載體表達(dá)綠色熒光蛋白較弱，不宜于在后續(xù)研究中應(yīng)用。pcDNA-R無(wú)熒光。pEGFP-CRI和pEGFP-CR2可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，pcDNA-GR可用于穩(wěn)定表達(dá)。 檢測(cè)了幾種常用細(xì)胞株對(duì)G418的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后最初的篩選，對(duì)于Vero E6、293和COS-7這3種細(xì)胞，使用800 mg／L的G418進(jìn)行，Hela細(xì)胞使用900mg／L的G418；對(duì)于篩選出來(lái)的穩(wěn)定細(xì)胞株，Hela細(xì)胞用300 mg／L的G41

13、8、其余3種可用200 mg／L的G418來(lái)維持抗性。 建立了通過(guò)手工分選以建立細(xì)胞株的方法。該方法先離出單個(gè)靶細(xì)胞，由單細(xì)胞生長(zhǎng)成1個(gè)克隆，再逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，直到獲得細(xì)胞株。根據(jù)該方法，分別用質(zhì)粒pcDNA-G、pcDNA-R和pcDNA-GIR轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞，建立了Vero-EGFP、Vero-RdRp和Vero-GIR等3種細(xì)胞株；用質(zhì)粒pcDNA-GIR轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，建立了293-GIR細(xì)胞株。 利

14、用體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成了6條siRNA：4條針對(duì)SARS病毒RdRp基因，1條針對(duì)EGFP基因，1條和所有的EST序列都沒(méi)有同源性的siNC，用作RNAi實(shí)驗(yàn)的負(fù)對(duì)照。這些siRNA為3’-端帶-UU突起的2l ntdsRNA，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最有效的siRNA的結(jié)構(gòu)形式。用Cy3標(biāo)記siRNA并轉(zhuǎn)染VeroE6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于質(zhì)粒，說(shuō)明在進(jìn)行siRNA和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)，能導(dǎo)入質(zhì)粒的細(xì)胞中基本都能同時(shí)導(dǎo)入siRNA，這為共轉(zhuǎn)染si

15、RNA和質(zhì)粒以進(jìn)行RNAi研究提供了一定參考。分別用這6條siRNA和融合表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-CRl共轉(zhuǎn)染’Vero E6細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡計(jì)數(shù)法判斷各RNAi組中EGFP表達(dá)受抑制的效率，隨后又應(yīng)用熒光定量RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，3種方法可以取得比較一致的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，各組siRNA的抑制效率分別為：siRl和siR2為85.90％，siR3和siR4為70-75％，siRl+SiR2為95％左右，siGF

16、P為80％左右，siNC為3％左右。熒光顯微鏡計(jì)數(shù)法可以方便快捷、連續(xù)動(dòng)態(tài)地對(duì)活細(xì)胞進(jìn)i行觀察分析，而且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，成為本研究中最主要的判斷RNAi效果的方法。 siRNA表達(dá)盒是另一種可用于RNAi研究的分子，它在導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，能轉(zhuǎn)錄出小的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA，進(jìn)而誘導(dǎo)啟動(dòng)RNm程序。本研究在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，用人的u6啟動(dòng)子構(gòu)建了RNAi效果最好的siR．1和siR2的SEC以及siGFP的SEC，在人胚胎腎上皮來(lái)源的

17、HEK293細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染SEC和pEGFP-CR．1，48 h后的熒光顯微鏡觀察和分析表明，SEC有著明顯的抑制靶基因表達(dá)的作用，其效率和相應(yīng)的siRNlA一致。 應(yīng)用尾靜脈高壓注射法將siRl和siR2與質(zhì)粒pEGFP．CRl一起導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，用定量RT．-PCR技術(shù)檢測(cè)了48 h后幾個(gè)重要器官中RdRp基因的表達(dá)，結(jié)果表明，siRNA在體內(nèi)有著和細(xì)胞中相似的RNAi效果，而且同一種siRNA在不同的器官中有著很一致的作用效