小鼠卵母細胞印跡基因DNA甲基化研究.pdf

1、哺乳動物卵巢卵母細胞發(fā)育的研究，最初主要關注生殖細胞形成的早期階段或出生后卵泡的生長發(fā)育。而原始卵泡的體外形成與發(fā)育激活方面，雖然有小鼠原始卵泡體外培養(yǎng)發(fā)育并可獲得成熟的卵母細胞的報道，但減數分裂前的雌性生殖細胞不能在體外完成這一卵母細胞發(fā)生與成熟的整個發(fā)育過程，其原因至今不甚清楚。鑒于此，本研究使用了本實驗室建立的減數分裂前的生殖細胞體外發(fā)育的培養(yǎng)體系，將12.5dpc雌性胎鼠生殖嵴中的減數分裂前的生殖細胞體外培養(yǎng)28天以后獲得GV期

2、的卵母細胞，并通過亞硫酸鹽測序法檢測了這些卵母細胞在體外培養(yǎng)過程中的DNA甲基化進程，探討卵母細胞印跡基因DNA甲基化與卵母細胞體外發(fā)育阻滯的關系。
　　 本研究首先是對12.5dpc胎鼠生殖嵴進行了體外培養(yǎng)，培養(yǎng)到7d時，出現圓形生殖細胞;14d時，出現典型的初級卵泡結構;21d時，卵母細胞直徑可達60μm，由顆粒細胞包裹，由于卵泡膜細胞的出現，此時已經形成了明顯的卵泡結構，但顆粒細胞增殖緩慢，只有2-3層，并且沒有卵泡腔的出

3、現;27d時，卵母細胞直徑最大可達70μm以上;28d時，一些卵母細胞能夠自發(fā)的從體外培養(yǎng)的組織中游離出來，并且具有明顯的透明帶和生發(fā)泡結構。其卵母細胞發(fā)育的各個時期，卵母細胞印跡基因Igf2r（Peg3）甲基化比例分別為6.3％、12％、9.3％和42.67％（3.3％、5.6％、4.4％和21.67％）;對照組卵母細胞分別來自于體內0、7、14和21dpp的新生鼠卵巢，其甲基化比例分別為5.6％、52.7％、80.1％和95.33％

4、（2.2％、33.3％、76.7％和88.98％）。由上述可見，印跡基因Igf2r和Peg3甲基化印跡的建立在卵母細胞體內生長和體外培養(yǎng)過程中存在一定差異。
　　 為了進一步了解12.5dpc胎鼠生殖嵴體外培養(yǎng)獲得的卵母細胞印跡基因甲基化模式的建立過程，本研究分析了卵母細胞直徑與印跡基因DNA甲基化的關系。將體外培養(yǎng)28d獲得的卵母細胞分成30-45μm、45-60μm和60-75μm三組，其印跡基因Igf2r和Peg3的甲基化

5、比例分別為17.33％、33.33％和94.44％（11.1％、26.11％和45％），這表明在體外隨著卵母細胞直徑的不斷增加，Igf2r和Peg3基因的DNA甲基化比例不斷提高。相關性分析表明，卵母細胞甲基化進程與直徑之間存在強正相關。另外，在相同直徑下，體外培養(yǎng)卵母細胞印跡基因DNA甲基化進程要慢于體內發(fā)育。
　　 本研究中還檢測了顆粒細胞增殖和分化前后，即初級卵泡向次級卵泡轉變過程、卵泡腔形成過程對卵母細胞印跡基因甲基化狀