《dna甲基化》ppt課件

1、DNA methylation,2010. 1.20,劉 丹,2,明星熊貓——“滾滾”,,,為什么熊貓是黑白的？,—— 基因決定命運,,1942年，Conrad Hal Waddington 提出表觀遺傳學( Epigenetics)的概念，以此解釋物種的內(nèi)在基因與外觀表現(xiàn)之間的關系。 基因序列(Genotype)的改變可能導致功能及表型(Phenotype)的改變。 基因型通過一些“偶然的、不確定的機制”決定了不同的表型

2、。 —— 生物的不同特征完全隨機獲得,Waddington's epigenetics,基因型,表型,,,Waddington's epigenetics,基因型,表型,,,DNA雙螺旋,基因的結構,基因表達受多種因素調(diào)控,,現(xiàn)代表觀遺傳學概念：基因的DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達水平與功能發(fā)生改變，并產(chǎn)生可遺傳的表型 —— 生物的不同特征由基因定向調(diào)控表觀遺傳學的現(xiàn)象（基因表達

3、的調(diào)控方式）：DNA甲基化 表觀遺傳學的核心（最初始的調(diào)控方式）組蛋白修飾MicroRNAGenomic imprinting,真核生物基因表達調(diào)控層次：1、DNA水平調(diào)節(jié)2、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)3、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)4、翻譯水平調(diào)節(jié)5、翻譯后加工的調(diào)節(jié),DNA,轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物RNA,mRNA,蛋白質(zhì)前體,mRNA降解物,活性蛋白質(zhì),,,,,,,,,DNA水平調(diào)節(jié),轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié),轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié),翻譯調(diào)節(jié),mRNA降解的調(diào)節(jié),

4、翻譯后加工的調(diào)節(jié),核,細胞質(zhì),DNA甲基化,,DNA methylation的定義,DNA methylation是唯一發(fā)生在哺乳動物細胞內(nèi)DNA 合成后的修飾作用,是調(diào)節(jié)基因表達的機理之一。 DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。 DNA甲基化能引起染色質(zhì)結構、DNA構象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達。,,,,DNA methylation的定義

5、,在甲基轉(zhuǎn)移酶（DMNT）的催化下，DNA的CG兩個核苷酸中的胞嘧啶（Cytosine）被選擇性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC），這常見于基因的5‘-CG-3’序列,DNA甲基化主要形成5-mC和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7-甲基鳥嘌呤（7-mG）,,,,,,,結構基因中廣泛存在著相鄰的兩個CG，其中胞嘧啶的5 位碳原子通常被甲基化, 且兩個甲基集團在DNA 雙鏈大溝中呈特定三維結構（CpG）,,CpG 島（cpg

6、island） 結構基因組中70%～ 90% 的獨立CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地聚集形成CpG 島主要位于結構基因的啟動子和第一外顯子區(qū)域，約有60％以上基因的啟動子含有CpG島。 — 是結構基因啟動子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點,,CPG island的功能：通過甲基化與去甲基化，調(diào)控下游基因的表達 ——

7、基因表達的調(diào)控開關,DNA methylation的生物學功能,在發(fā)育和分化中調(diào)控基因的表達；特征性表型基因的表達（膚色、毛發(fā)） X染色體的失活（X-inactivation ）,,,DNA甲基化生物學作用,IAP: intracisternal A particle去甲基化：灰鼠基因（agouti）僅微量表達甲基化：基因超量表達,,X染色體的失活（X-inactivation ） 生長發(fā)育過程中，雌性哺乳類動物細胞中的兩

8、條X染色體其中一條失去活性的現(xiàn)象。 避免因擁有兩條X染色體而產(chǎn)生 雙倍的基因產(chǎn)物，保持和雄性動物 X染色體數(shù)量及功能上的一致性。,X染色體上存在一個與X染色體失活有密切聯(lián)系的核心部位。核心區(qū)命名位X染色體失活中心（X-chormosome inactivation center，Xic），其定位在人Xq13區(qū)（Barr氏小體濃縮部位）。研究發(fā)現(xiàn)失活的染色體上DNA序列都呈高度甲基化，導致絕大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄處于關閉狀態(tài)

9、。,X-chromosome inactivation,雌性家貓的一條X染色體完全失去活性,,Rainbow,Copy Cat,Allie,,X染色體失活,影響DNA methylation的調(diào)控因素,DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的活性 哺乳動物體內(nèi)有三種DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶：Dnmt1、Dnmt3a 和Dnmt3b。DNMT1--- 持續(xù)性DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶；與甲基化相關，缺乏引起基因組低甲基化，染色體缺失、重排、突變

10、畸形DNMT3a、DNMT3b--- 從頭甲基轉(zhuǎn)移酶；與去甲基化相關，在胚胎干細胞和早期胚胎中高度表達，缺乏引起胚胎死亡，在腫瘤組織中廣泛高表達,,,SCIENCE VOL 300 18 APRIL 2003,,正常小鼠 (Dnmt1 +/+) —— 陽性對照DNM1酶缺乏小鼠模型 (Dnmt1 chip/–) —— 實驗組Embryonic stem (ES) 細胞 (Dnmt1 –/–) ——

11、 陰性對照,,Dnmt1 chip/–小鼠Dnmt1酶的表達量明顯減少，大約為正常小鼠的10%,,,Dnmt1 chip/–小鼠體重僅為正常小鼠66% 80%的小鼠在4-8個月內(nèi)產(chǎn)生T細胞性淋巴瘤,,,c-myc癌基因在Dnmt1 chip/–小鼠中異常高表達,影響DNA methylation的調(diào)控因素,組蛋白的甲基化 真核生物的組蛋白N 末端或C 末端氨基酸殘基可生乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化等共價修飾，并影響基因轉(zhuǎn)錄。

12、 H3K9 的甲基化與DNA 的甲基化在基因的沉默機制中具有協(xié)同作用 H3K4 的甲基化拮抗DNA 甲基化所產(chǎn)生的基因沉默,影響DNA methylation的調(diào)控因素,RNA 干擾一般認為RNA 干擾( RNAi) 是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象 —— 翻譯、轉(zhuǎn)錄后水平siRNA 指導DNA 甲基化(RdDM) 現(xiàn)象證實：siRNA 可以通過DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1和Dnmt3b介導DNA 甲基化—— DNA水

13、平,,DNA methylation and Oncology,正常生物DNA甲基化,DNA甲基化始發(fā)于胚胎早期，隨著組織細胞分化發(fā)育，基因組DNA經(jīng)歷了去甲基化、區(qū)域性的重新甲基化以及組織特異基因選擇性的去甲基化的過程。最后，這種DNA甲基化模式就相對穩(wěn)定下來。,腫瘤組織的DNA甲基化,腫瘤中普遍存在DNA甲基化狀態(tài)的改變，其特點是總體的甲基化水平降低與局部的甲基化水平升高。 低甲基化可誘導原癌基因和轉(zhuǎn)座子成分活化，基因印

14、跡缺失以及染色體不穩(wěn)定性增加，最終誘發(fā)腫瘤 在整體低甲基化的水平下，某些抑癌基因發(fā)生高甲基化，導致基因沉默，對腫瘤抑制能力低下,,,DNA甲基化與腫瘤的關系,腫瘤細胞的特征：癌基因低甲基化 ——被激活；抑癌基因高甲基化 ——被沉默 甲基化水平與腫瘤生物學特性密切相關，DNA甲基化水平越低，染色體越容易發(fā)生功能異常，腫瘤的浸潤能力就越高，臨床分期也愈晚,常見易被甲基化的抑癌基因與修復基因及其作用,,,,有學

15、者研究認為,DNA甲基化是繼基因結構變異即突變和缺失之后的第3種抑癌基因失活機制。 CpG島保護因子缺乏 DNMT3高表達和DNMT復合體調(diào)控障礙 復制周期時間錯誤 DNA甲基化導致遺傳不穩(wěn)定性。,Milutinovic S, DNA methyltransferase inhibition induces the transcription of the tumor suppressor p21(WAF1/CIP1/ sd

16、i1) [J ]. J Biol Chem, 2000, 275 (9) : 6 353 - 6 359.,DNA methylation的應用前景,腫瘤的早期診斷 基因啟動子區(qū)域的CpG島甲基化能沉默基因轉(zhuǎn)錄，在正常細胞中是一種調(diào)節(jié)基因表達的手段。然而抑癌基因發(fā)生異常甲基化是在腫瘤早期就發(fā)生而且一直進行的，導致惡性腫瘤表型的表達,DNA methylation的應用前景,,,,DNA methylation的應用前景,Kue

17、ster 報道在88.19% ( 24 /27 ) 食管Barrett’s化生病例和100% (13 /13)的上皮內(nèi)瘤變病例中檢測到MGMT基因異常甲基化，提示MGMT甲基化是食管腺癌早期頻繁發(fā)生的事件。Kelavkar 等發(fā)現(xiàn)ALDX15基因在前列腺上皮內(nèi)瘤變、前列腺癌中以異常甲基化存在；而在正常前列腺細胞系中是以非甲基化狀態(tài)存在，說明其異常甲基化與前列腺癌的發(fā)生關系密切。,1.KUESTER D, et al. Silencin

18、g of MGMT expression by promoter hypermethylation in the metap lasia -dysp lasia - carcinoma sequence of Barrett’s esophagus. CancerLett, 2009, 275 (1) : 117 - 126.2.KELAVKAR P, et al. DNA methylation paradigm shift: 15

19、 - Lipoxygenase - 1 up regulation in p rostatic intraep ithelial neop lasia and p rostate cancer by atyp ical p romoter hypermethylation. Prostaglandins Other Lip id Mediat,2007, 82 (1 - 4) : 185 - 197.,DNA methylation的應

20、用前景,優(yōu)點：DNA甲基化檢測具有早期、無創(chuàng)、快捷、靈敏度高等特點。（血液、粘膜上皮標本）缺點：特異性不足,DNA methylation的應用前景,腫瘤的預后分析甲基化改變與腫瘤分級、分期有明顯的相關性。 RASSF1A甲基化在低分化肺癌中比在高分化中更常見 在結直腸癌Dukes分期C和D 的病例中CDKN2A, p16 的甲基化率比A 和B 期的增高,DAS PM, DNA methylation and cancer

21、. J ClinOncol, 2004, 22 (22) : 4 632 - 4 642,DNA methylation的應用前景,DNA異常甲基化可促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移 乳腺癌中Cyclin D2, RAR - β, Twist, RASSF1A和H IN - 1的甲基化改變與淋巴結、骨、腦、肺轉(zhuǎn)移有關,MEHROTRA J, et al. Very high frequency of hypermethylated gene

22、s in breast cancermetastasis to the bone, brain, and lung . Clin Cancer Res, 2004, 10 ( 9 ) :3 104 - 3 109.,DNA methylation的應用前景,甲基化可作為腫瘤復發(fā)的獨立預測因子。 口腔鱗狀細胞癌時存在RECK基因甲基化的患者復發(fā)率明顯增高甲基化影響生存期 膀胱癌中APC, GSTP1和TIG1基因發(fā)生異常

23、甲基化時,患者存活時間明顯縮短,LONG N K, et al. Hypermethylation of the RECK gene p redicts poor p rognosis in oral squamous cell carcinomas[ J ]. Oral Oncol, 2008, 44 (11) : 1 052 - 1 058.ELL INGER J, et al. Hypermethylation of Cel -

24、 Free Serum DNA IndicatesWorse Outcome in Patients With Bladder Cancer. J Urol, 2008, 179 (1) : 346 - 352.,DNA methylation的應用前景,腫瘤的去甲基化治療 DNA甲基化程度依賴于DNMT活性。正常甲基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用， DNMT1是DNMT3啟動CpG核苷酸從頭甲基化的保證，

25、而DNMT3則使甲基化水平穩(wěn)定在正常需要水平（去甲基化） —— 抑制DNMT活性藥物是治療腫瘤的新希望,,胞苷類似物通過共價鍵與DNMT形成不可逆的復合物從而競爭性抑制其活性,使DNA甲基化隨細胞分裂進行性丟失,部分地逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表型。 5-Azacytidine 5-氮雜胞苷 5-aza-2‘-deoxycytidine 5-雜-2‘脫氧胞苷 Decitabine 4-氨基-1-(2-脫氧-β-D-赤式-順-呋喃核