流體剪應(yīng)力對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是中老年人的一種常見(jiàn)病，是以骨量減少、骨組織微觀(guān)結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增高而骨折危險(xiǎn)性增加的一種全身性疾病。一般情況下，3位女性有1人易患骨質(zhì)疏松癥，而男性一般是12人中有1人患骨質(zhì)疏松癥。可見(jiàn)，骨質(zhì)疏松癥是發(fā)病率、死亡率和醫(yī)療保健消耗較大的疾病。因此，骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療是很重要的。影響骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的因素有很多，力學(xué)負(fù)荷是其重要因素之一。體外研究已證實(shí)，力學(xué)負(fù)荷在正常骨組織的發(fā)

2、育過(guò)程中具有重要的作用。骨組織中的腔隙結(jié)構(gòu)構(gòu)成縱橫交錯(cuò)的三維網(wǎng)絡(luò)，這些腔隙中充滿(mǎn)了組織液。正?；顒?dòng)對(duì)骨組織施加的機(jī)械負(fù)荷，將引起這些腔隙體積的變化，從而形成液壓促進(jìn)流動(dòng)，因此認(rèn)為在骨組織內(nèi)，這種液體的流動(dòng)產(chǎn)生的剪應(yīng)力可能在骨的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。然而，破骨細(xì)胞對(duì)剪應(yīng)力是否敏感，破骨細(xì)胞是如何將力學(xué)刺激信號(hào)轉(zhuǎn)換成生物化學(xué)信號(hào)，在骨質(zhì)疏松中破骨細(xì)胞對(duì)力學(xué)刺激的敏感性是否有變化，目前仍不清楚。因此，我們假設(shè)，破骨細(xì)胞和前提破骨細(xì)胞是

3、剪應(yīng)力敏感細(xì)胞，破骨細(xì)胞表面integrinα<,v>β<,3>參與破骨細(xì)胞中力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究的目的就是：1)探討剪應(yīng)力對(duì)正常和去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠破骨細(xì)胞骨吸收功能活性的影響；2)探討破骨細(xì)胞integrinα<,v>β<,3>在力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)中可能的分子機(jī)理。 1.骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的建立選用健康6月齡雌性未生育Sprague-Dawley(SD)大鼠，采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)，建立模擬人絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為2組：對(duì)

4、照組(control)，不切除卵巢、卵巢切除組(ovx)，切除雙側(cè)卵巢。手術(shù)后3個(gè)月處死動(dòng)物，檢測(cè)動(dòng)物體重、子宮重量；做骨組織病理學(xué)切片，觀(guān)察骨組織形態(tài)學(xué)和骨細(xì)胞功能活性的變化，以確定模型建立成功。 2.破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)無(wú)菌分離大鼠腰椎(L<,1-5>)，采用機(jī)械分離法和1，25-(OH)<,2>VitD<,3>全骨髓誘導(dǎo)法相結(jié)合，從大鼠椎骨骨髓細(xì)胞中獲取破骨細(xì)胞，以細(xì)胞形態(tài)、TRAP染色陽(yáng)性、骨吸收陷窩的形成、細(xì)胞骨架等指標(biāo)觀(guān)

5、察、鑒定破骨細(xì)胞。 3.羥基磷灰石涂層蓋玻片的制備由于對(duì)骨片的加力裝置設(shè)計(jì)較難，考慮人體內(nèi)骨組織無(wú)機(jī)成分主要是羥基磷灰石。因此，我們采用羥基磷灰石涂層血蓋片的方法來(lái)模擬體內(nèi)骨基質(zhì)吸收情況。以Ca(NO<,3>)<,2>·4H<,2>O和P<,2>O<,6>為原材料，采用溶膠一凝膠法制備羥基磷灰石涂層蓋玻片，模擬破骨細(xì)胞在骨片上的骨吸收情況。 4.剪應(yīng)力對(duì)破骨細(xì)胞功能活性影響的檢測(cè) 1)采用本室自制的流體剪應(yīng)力加載

6、系統(tǒng)對(duì)所選用的破骨細(xì)胞分別施加0、5.97、11.36、16.08、20.54dyne/cm<'3>的剪應(yīng)力，作用30min；每次剪應(yīng)力作用結(jié)束后，收集灌流液10ml凍存，備用。用紫外分光光度儀檢測(cè)TRAP活性；采用羥基磷灰石涂層蓋玻片模擬體內(nèi)骨基質(zhì)吸收情況，以?huà)呙桦娮语@微鏡和圖像分析軟件檢測(cè)骨吸收陷窩數(shù)量和面積，觀(guān)察不同剪應(yīng)力強(qiáng)度對(duì)正常和骨質(zhì)疏松大鼠破骨細(xì)胞功能活性的影響； 2)再根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)破骨細(xì)胞功能活性影響最

7、大的剪應(yīng)力強(qiáng)度，觀(guān)察剪應(yīng)力作用不同時(shí)間，正常和骨質(zhì)疏松大鼠破骨細(xì)胞骨吸收功能活性的變化； 5.剪應(yīng)力對(duì)破骨細(xì)胞表面用integrinα<,v>β<,3>表達(dá)影響的檢測(cè)采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)剪應(yīng)力作用對(duì)破骨細(xì)胞表面integrinα<,v>β<,3>表達(dá)的影響6.破骨細(xì)胞表面integrinα<,v>β<,3>表達(dá)量與破骨細(xì)胞骨吸收功能關(guān)系分析用integrinα<,v>β<,3>單克隆抗體(sc-7312)孵育破骨細(xì)胞30min，

8、阻斷破骨細(xì)胞表面integrinα<,v>β<,3>的表達(dá)，對(duì)破骨細(xì)胞作用相同的剪應(yīng)力，同樣用掃描電子顯微鏡技術(shù)和圖像分析軟件分析破骨細(xì)胞骨吸收功能的變化。 結(jié)果: 1.去卵巢手術(shù)后3個(gè)月，OVX組大鼠體重明顯增加(p<0.01)；子宮明顯萎縮，重量降低(p<0.01)；骨組織病理學(xué)切片顯示骨小梁分離、斷裂，數(shù)量減少，骨髓腔內(nèi)含有大量脂肪細(xì)胞，骨膠原中有大量新生膠原纖維形成，破骨細(xì)胞骨吸收殘跡明顯增加，符合骨質(zhì)疏松的特點(diǎn)

9、。 2.以機(jī)械分離法和1，25-(OH)<,2>VitD<,3>全骨髓誘導(dǎo)法相結(jié)合從大鼠椎骨骨髓細(xì)胞中獲取破骨細(xì)胞，在誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天，所獲破骨細(xì)胞數(shù)量最多，TRAP活性最佳。且在培養(yǎng)第1天骨質(zhì)疏松組大鼠破骨細(xì)胞數(shù)和TRAP活性高于正常大鼠組。 3.羥基磷灰石(HA)涂層蓋玻片可模擬骨基質(zhì)吸收情況，破骨細(xì)胞在姒蓋玻片上培養(yǎng)可以形成骨吸收陷窩。 4.在我們所選用的剪應(yīng)力范圍內(nèi)，作用破骨細(xì)胞30min后，正常大鼠和骨質(zhì)

10、疏松大鼠破骨細(xì)胞TRAP活性、骨吸收陷窩數(shù)量和面積均較靜態(tài)時(shí)增高(p<0.01)，以16.08dyne/cm<,2>的剪應(yīng)力作用最明顯；但骨質(zhì)疏松大鼠破骨細(xì)胞功能活性的增高低于正常大鼠破骨細(xì)胞(p<0.05)。 5.16.08dyne/cm<'2>的剪應(yīng)力作用破骨細(xì)胞不同時(shí)段，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，破骨細(xì)胞骨吸收陷窩數(shù)量和面積逐漸增加，至60min達(dá)峰值，之后骨吸收陷窩數(shù)量和面積無(wú)明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)。 6.破骨細(xì)胞表面integr

11、inα<,v>β<,3>表達(dá)隨剪應(yīng)力作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，至作用60min，達(dá)峰值，之后呈下降趨勢(shì)。 7．阻斷破骨細(xì)胞表面integrinα<,v>β<,3>后，作用相同剪應(yīng)力破骨細(xì)胞骨吸收陷窩數(shù)量和面積的增長(zhǎng)明顯低于integrinα<,v>β<,3>阻斷前(p<0.05)。 結(jié)論: 1．健康6月齡雌性未生育SD大鼠去卵巢手術(shù)后3個(gè)月，可建立去卵巢后大鼠骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。 2．以機(jī)械分離法和1，25-(O

12、H)<,2>VitD<,3>全骨髓誘導(dǎo)法相結(jié)合，培養(yǎng)的破骨細(xì)胞在第7天最多，TRAP活性最強(qiáng)。 3．羥基磷灰石涂層蓋玻片，可模擬體內(nèi)骨基質(zhì)吸收情況；可代替骨片檢測(cè)破骨細(xì)胞骨吸收功能。為體外破骨細(xì)胞骨吸收功能的檢測(cè)提供了一種新的研究手段。 4．一定強(qiáng)度剪應(yīng)力作用，可促進(jìn)破骨細(xì)胞骨吸收功能活性。一定時(shí)段剪應(yīng)力作用可上調(diào)破骨細(xì)胞表面integrinα<,v>β<,3>的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞骨吸收活性增強(qiáng)，且這種變化具有時(shí)間依賴(lài)性