健步虎潛丸對體外成骨樣細(xì)胞功能影響及防治去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的實驗研究.pdf

1、背景：
　　隨著人口老齡化的進(jìn)程，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率逐年上升，嚴(yán)重影響老年人的健康。雖化學(xué)藥物制劑療效確切，但是長期使用毒副作用大，且主要以抑制骨吸收為主。應(yīng)該尋求更加有效而安全的抗骨質(zhì)疏松藥物。大量研究表明，理想的抗骨質(zhì)疏松藥物應(yīng)該是既能夠抑制骨吸收，又能夠促進(jìn)骨的形成，且副作用少，價格便宜?！敖〔交撏琛背鲎浴秱蒲a要》卷三，其療效已經(jīng)為長期臨床所證實。
　　目的：
　　研究健步虎潛丸對體外成骨樣細(xì)胞增殖及功能影響

2、,并進(jìn)一步研究其對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防作用。本研究擬為開發(fā)新型有效的防治骨質(zhì)疏松癥藥物奠定基礎(chǔ),促進(jìn)防治骨質(zhì)疏松癥復(fù)方中藥的現(xiàn)代化和國際化。
　　材料與方法：
　　1.24只成年雌性SD大鼠隨機分為健步虎潛丸組低劑量組、中劑量組、高劑量組及生理鹽水組，并分別以含生藥1.5g/kg、3g/kg、6g/kg的健步虎潛丸及等體積的生理鹽水灌胃，每天2次，連續(xù)給藥1周。以各組血清分別處理成骨樣細(xì)胞24、48、72小時，觀察細(xì)胞

3、形態(tài)學(xué)，同時對細(xì)胞增殖能力進(jìn)行測定。
　　2.24只成雌性SD大鼠隨機分為健步虎潛丸組低劑量組、中劑量組、高劑量組及生理鹽水組，并分別以含生藥1.5g/kg、3g/kg、6g/kg的健步虎潛丸及等體積的生理鹽水灌胃，每天2次，連續(xù)給藥1周。各組血清分別處理成骨樣細(xì)胞24、48、72小時，對堿性磷酸酶染色的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，同時對堿性磷酸酶活性進(jìn)行測定。
　　3.70只成年雌性SD去卵巢大鼠隨機分為健步虎潛丸組低劑量組、中劑

4、量組、高劑量組、生理鹽水組及阿侖磷酸鈉組，并分別以含生藥1.5g/kg、3g/kg、6g/kg的健步虎潛丸、等體積的生理鹽水灌胃、1mg/kg阿侖膦酸鈉灌胃，健步虎潛丸各組及生理鹽水組每天灌胃2次，阿侖磷酸鈉組每天灌胃1次。16周后進(jìn)行血清酶學(xué)、影象學(xué)、骨密度、骨顯微形態(tài)計量學(xué)、生物力學(xué)及組織學(xué)的檢測。
　　結(jié)果：
　　1．健步虎潛丸含藥血清對ROS17/2.8成骨樣細(xì)胞形態(tài)影響：從24小時開始健步虎潛丸低劑量組、健步虎潛丸

5、中劑量組及健步虎潛丸高劑量組的細(xì)胞密度高于對照組,核分裂相多見,細(xì)胞重疊生長,分泌物多,基質(zhì)堆積明顯,健步虎潛丸高劑量組細(xì)胞改變尤為顯著。
　　2．健步虎潛丸含藥血清對ROS17/2.8成骨樣細(xì)胞增殖能力：實驗各組內(nèi)的MTT值24h、48h、72h逐漸增加，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。24h、48h、72h各干預(yù)組較對照組MTT值明顯增加，具有有顯著性差異。24h時健步虎潛丸中、高劑量組較低劑量組MTT值明顯增加，具有有顯著性差異；24h

6、時虎潛丸中、高劑量組MTT值沒有顯著性差異。48h、72h時各干預(yù)組組間比較，隨干預(yù)劑量增加，MTT值增加，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3．ROS17/2.8成骨樣細(xì)胞的堿性磷酸酶染色：24h、48h時，各干預(yù)組及對照組堿性均磷酸酶染色陽性，但各濃度干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)的堿性磷酸酶染色肉眼未見明顯差異。72h時，各不同濃度干預(yù)組及正常組其ROS17/2.8成骨樣細(xì)胞內(nèi)堿性均為磷酸酶染色陽性,對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組堿性磷酸酶著色

7、逐漸加深。
　　4．健步虎潛丸含藥血清對ROS17/2.8成骨樣細(xì)胞堿性磷酸酶活性：隨著時間增加，實驗各組內(nèi)的MTT值堿性磷酸酶活性值逐漸增加，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義；24h、48h、72h各干預(yù)組較對照組MTT值明顯增加，具有有顯著性差異。24h、48h、72h時各干預(yù)組組間比較，隨干預(yù)劑量增加，堿性磷酸酶活性值逐漸增加，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　5.大鼠血清骨鈣素：與卵巢切除對照組相比，健步虎潛丸各劑量組骨鈣素水平顯著升高，

8、結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異，阿侖膦酸鈉組骨鈣素水平水平顯著降低，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。健步虎潛丸各劑量組隨劑量增加，骨鈣素水平有升高的趨勢，但結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。和阿侖膦酸鈉組相比，各劑量組骨鈣素水平顯著升高，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　6.酒石酸酸性磷酸酶5b（TRAP-5b）：與卵巢切除對照組相比，各藥物治療組酒石酸酸性磷酸酶5b水平顯著降低，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。健步虎潛丸各劑量組隨劑量增加，酒石酸酸性磷酸酶5b有降低的趨勢，但結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)

9、差異。和阿侖膦酸鈉組相比，健步虎潛丸各劑量組的酒石酸酸性磷酸酶5b無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　7.影象學(xué)檢查：對照組其骨皮質(zhì)薄，邊緣模糊，松質(zhì)骨的透光度較高，各藥物干預(yù)組較對照組相比股骨的骨皮質(zhì)更厚，松質(zhì)骨透光度更低。
　　8.骨密度：與卵巢切除對照組相比，各藥物干預(yù)組股骨和腰椎骨密度顯著增加，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異；各藥物干預(yù)組組間相比，股骨和腰椎骨密度沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　9.三點彎曲實驗：與卵巢切除對照組相比，各藥物干預(yù)組股

10、骨最大負(fù)荷顯著增加，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異；健步虎潛丸各劑量組組間相比，股骨最大負(fù)荷無統(tǒng)計學(xué)差異；與阿侖膦酸鈉組相比，健步虎潛丸各劑量組股骨最大負(fù)荷顯著增加，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。與卵巢切除對照組相比，各藥物干預(yù)組股骨最大負(fù)荷下形變有增高趨勢，但是結(jié)果均沒有統(tǒng)計學(xué)差異；與阿侖膦酸鈉組相比，健步虎潛丸各劑量組最大負(fù)荷有增高趨勢，結(jié)果沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　10.腰椎壓縮實驗：與卵巢切除對照組相比，各藥物干預(yù)組腰椎最大載荷顯著增加，結(jié)果具有統(tǒng)

11、計學(xué)差異。健步虎潛丸各劑量組組間相比，腰椎最大載荷無統(tǒng)計學(xué)差異。與阿侖膦酸鈉組相比，健步虎潛丸各劑量組腰椎最大載荷顯著增加，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　11.骨形態(tài)計量學(xué)：與卵巢切除對照組相比，各藥物干預(yù)組Tb.Ar、Tb.N顯著增加，Tb.Sp顯著降低，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異；Tb.Th沒有統(tǒng)計學(xué)差異。各藥物干預(yù)組組間Tb.Ar、Tb.N、Tb.Sp、Tb.Th沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　12.組織學(xué)顯示：腰椎HE、Masson染色及

12、股骨HE、Masson染色顯示各干預(yù)組骨小梁排列密集,小梁厚度寬、間距小,骨小梁之間的連接較多；而卵巢切除對照組骨小梁排列稀疏,數(shù)目減少,小梁明顯變細(xì)、間距加寬,骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較大的空白區(qū)域。
　　結(jié)論：
　　1.健步虎潛丸含藥血清能促進(jìn)成骨樣細(xì)胞ROS17/2.8的增殖且存在濃度依賴性及時間依耐性。
　　2.健步虎潛丸含藥血清能促進(jìn)成骨樣細(xì)胞的活性且存在濃度依賴性及時間依耐性。
　　3.健步虎潛丸各劑量組均能改

13、善去卵巢大鼠的骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)，有效促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收。
　　4.健步虎潛丸各劑量組均能有效增加去卵巢大鼠腰椎和股骨BMD。
　　5.健步虎潛丸各劑量組改善去卵巢大鼠的腰椎及股骨的生物力學(xué)性能，可降低去勢大鼠骨質(zhì)疏松骨折風(fēng)險。
　　6.健步虎潛丸各劑量組均能改善去卵巢大鼠骨骼微觀結(jié)構(gòu)，以提高骨質(zhì)量。
　　7.健步虎潛丸各劑量組組織學(xué)觀察骨小梁排列更密集,小梁厚度更寬、間距更小,骨小梁之間連接增加。
　　8.健