貴州侗族HBV感染人群CCR5基因表達(dá)及其啟動子區(qū)59029G-A、59353C-T位點點突變的功能研究.pdf

1、目的: 檢測侗族 HBV感染人群外周血白細(xì)胞中 CC類趨化因子受體5（CC chemokine receptor5, CCR5）mRNA及蛋白的表達(dá)。同時探討 CCR5基因啟動子區(qū)多態(tài)位點59029(G→A)、59353(C→T)位點點突變對基因轉(zhuǎn)錄活性的影響，探討其與乙肝感染發(fā)病機制的相關(guān)性，為乙肝的防治、篩選候選藥物靶標(biāo)分子研究提供理論依據(jù)。
　　方法: 選擇貴州從江侗族人群，分為HBV感染組和非感染組，當(dāng)?shù)亟】等巳鹤鳛閷φ战M

2、（非感染組），分離各組靜脈血白細(xì)胞，并分別提取白細(xì)胞中 RNA和蛋白質(zhì)。采用實時熒光定量 PCR方法檢測 HBV感染組、非感染組人群外周血白細(xì)胞中 CCR5 mRNA的表達(dá)。采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immuno sorbent assay, ELISA）測定 HBV感染組、非感染組人群外周血白細(xì)胞中 CCR5蛋白。從本室少數(shù)民族基因庫中選出貴州從江侗族HBV感染人群 DNA標(biāo)本，對 CCR5基因啟動子區(qū) SNP位

3、點59029G/A（rs1799987）、59353C/T（rs1799988）進行功能學(xué)的初步研究，PCR方法分別擴增出不同的兩個基因片段，其中一個片段含有CCR559029G/A位點，另一個片段含59353C/T位點，克隆至螢火蟲熒光素酶報告基因載體 pGL3-Basic上，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pGL3-G、pGL3-A、pGL3-C、 pGL3-T，并分別與海腎熒光素酶報告基因載體 pRL-TK瞬時轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞株（HepG2），優(yōu)化

4、 HepG2細(xì)胞電轉(zhuǎn)條件后，分別采用FuGENE6、電穿孔法轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞。利用雙熒光素酶報告基因檢測分析 CCR5基因啟動子區(qū)59029G/A、59353C/T位點點突變對基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　結(jié)果: 用SPSS18.0軟件統(tǒng)計各組人群外周血白細(xì)胞中 CCR5 mRNA及蛋白水平的表達(dá)區(qū)別，分析其與乙肝病毒感染的關(guān)聯(lián)性，并比較雙熒光素酶的表達(dá)差別。結(jié)果 HBV感染組人群外周血白細(xì)胞中 CCR5 mRNA表達(dá)水平較對照組

5、降低（P<0.05）；HBV感染組人群外周血白細(xì)胞中 CCR5蛋白表達(dá)水平較非感染組明顯降低（P<0.05）。經(jīng) PCR方法分別擴增出大小為412 bp含 CCR559029G/A位點的啟動子片段、437bp含 CCR559353C/T位點的啟動子片段，成功構(gòu)建 CCR5基因啟動子重組質(zhì)粒 pGL3-G、pGL3-A、pGL3-C、pGL3-T，質(zhì)粒雙酶切和測序結(jié)果完全正確，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。優(yōu)化電轉(zhuǎn)染條件后，HepG2可獲得轉(zhuǎn)染率（6

6、0.68±1.87）％，而FuGENE6法的轉(zhuǎn)染率為（33.5±2.66）%。瞬時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至 HepG2，經(jīng)雙熒光素酶報告基因檢測分析，CCR5基因59029G/A位點、59353C/T位點發(fā)生遺傳變異后，轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生明顯改變，重組質(zhì)粒 pGL3-G比 pGL3-A報告基因熒光素酶表達(dá)增加了28%，重組質(zhì)粒 pGL3-C比 pGL3-T使報告基因熒光素酶表達(dá)增加了16%。
　　結(jié)論: 推測侗族 HBV感染人群 CCR5表達(dá)情況