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1、目的: 檢測(cè)侗族 HBV感染人群外周血白細(xì)胞中 CC類趨化因子受體5(CC chemokine receptor5, CCR5)mRNA及蛋白的表達(dá)。同時(shí)探討 CCR5基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)位點(diǎn)59029(G→A)、59353(C→T)位點(diǎn)點(diǎn)突變對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性的影響,探討其與乙肝感染發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性,為乙肝的防治、篩選候選藥物靶標(biāo)分子研究提供理論依據(jù)。
方法: 選擇貴州從江侗族人群,分為HBV感染組和非感染組,當(dāng)?shù)亟】等巳鹤鳛閷?duì)照組
2、(非感染組),分離各組靜脈血白細(xì)胞,并分別提取白細(xì)胞中 RNA和蛋白質(zhì)。采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法檢測(cè) HBV感染組、非感染組人群外周血白細(xì)胞中 CCR5 mRNA的表達(dá)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immuno sorbent assay, ELISA)測(cè)定 HBV感染組、非感染組人群外周血白細(xì)胞中 CCR5蛋白。從本室少數(shù)民族基因庫(kù)中選出貴州從江侗族HBV感染人群 DNA標(biāo)本,對(duì) CCR5基因啟動(dòng)子區(qū) SNP位
3、點(diǎn)59029G/A(rs1799987)、59353C/T(rs1799988)進(jìn)行功能學(xué)的初步研究,PCR方法分別擴(kuò)增出不同的兩個(gè)基因片段,其中一個(gè)片段含有CCR559029G/A位點(diǎn),另一個(gè)片段含59353C/T位點(diǎn),克隆至螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體 pGL3-Basic上,構(gòu)建重組質(zhì)粒 pGL3-G、pGL3-A、pGL3-C、 pGL3-T,并分別與海腎熒光素酶報(bào)告基因載體 pRL-TK瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞株(HepG2),優(yōu)化
4、 HepG2細(xì)胞電轉(zhuǎn)條件后,分別采用FuGENE6、電穿孔法轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞。利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分析 CCR5基因啟動(dòng)子區(qū)59029G/A、59353C/T位點(diǎn)點(diǎn)突變對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。
結(jié)果: 用SPSS18.0軟件統(tǒng)計(jì)各組人群外周血白細(xì)胞中 CCR5 mRNA及蛋白水平的表達(dá)區(qū)別,分析其與乙肝病毒感染的關(guān)聯(lián)性,并比較雙熒光素酶的表達(dá)差別。結(jié)果 HBV感染組人群外周血白細(xì)胞中 CCR5 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組
5、降低(P<0.05);HBV感染組人群外周血白細(xì)胞中 CCR5蛋白表達(dá)水平較非感染組明顯降低(P<0.05)。經(jīng) PCR方法分別擴(kuò)增出大小為412 bp含 CCR559029G/A位點(diǎn)的啟動(dòng)子片段、437bp含 CCR559353C/T位點(diǎn)的啟動(dòng)子片段,成功構(gòu)建 CCR5基因啟動(dòng)子重組質(zhì)粒 pGL3-G、pGL3-A、pGL3-C、pGL3-T,質(zhì)粒雙酶切和測(cè)序結(jié)果完全正確,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。優(yōu)化電轉(zhuǎn)染條件后,HepG2可獲得轉(zhuǎn)染率(6
6、0.68±1.87)%,而FuGENE6法的轉(zhuǎn)染率為(33.5±2.66)%。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至 HepG2,經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分析,CCR5基因59029G/A位點(diǎn)、59353C/T位點(diǎn)發(fā)生遺傳變異后,轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生明顯改變,重組質(zhì)粒 pGL3-G比 pGL3-A報(bào)告基因熒光素酶表達(dá)增加了28%,重組質(zhì)粒 pGL3-C比 pGL3-T使報(bào)告基因熒光素酶表達(dá)增加了16%。
結(jié)論: 推測(cè)侗族 HBV感染人群 CCR5表達(dá)情況
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