雞CCT6A基因的功能及啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性研究.pdf

1、CCT是真核生物胞漿中唯一的伴侶素，屬Ⅱ型伴侶素，是一種廣泛存在于細(xì)胞漿中的異型寡聚蛋白，在肌動(dòng)蛋白、微管蛋白的組裝和折疊中發(fā)揮著重要的作用。CCT6A是CCT的ξ亞基。在開產(chǎn)后的雞卵巢中CCT6A的mRNA表達(dá)量顯著升高，孕激素處理雞卵泡顆粒細(xì)胞，可顯著上調(diào)CCT6A基因的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)CCT6A啟動(dòng)子區(qū)存在孕酮受體結(jié)合元件(PREs)，表明CCT6A基因參與孕酮調(diào)控通路。以上研究揭示了CCT6A基因在卵泡發(fā)育中的重要作用。但其在雞卵泡

2、發(fā)育中的功能及表達(dá)調(diào)控的相關(guān)研究還很少。
　　本研究通過qRT-PCR分析得到CCT6A基因在雞卵泡膜細(xì)胞中的mRNA表達(dá)量顯著高于顆粒細(xì)胞，并在F4卵泡膜細(xì)胞中表達(dá)量最高。通過構(gòu)建雞卵泡膜細(xì)胞的體外模型，并利用pGPU6/GFP/Neo真核表達(dá)載體為骨架，構(gòu)建靶向CCT6A mRNA序列的shRNA表達(dá)載體:pGPU6/GFP/Neo-shRNA-213/699/1272/1404和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC。

3、將shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)雞卵泡膜細(xì)胞中，48 h后檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1272后，CCT6A基因在mRNA和蛋白表達(dá)水平均最低并達(dá)到顯著(P＜0.05)。研究篩選出的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1272表達(dá)載體能高效抑制雞卵泡膜細(xì)胞中CCT6A mRNA和蛋白的表達(dá)。干擾CCT6A基因后BCL-2基因表達(dá)降低，抑制膜細(xì)胞增殖，細(xì)胞形態(tài)由多邊形或星形變得細(xì)長(zhǎng)，此結(jié)果表明CCT6A在雞卵泡膜細(xì)

4、胞增殖中發(fā)揮重要作用，為研究CCT6A在雞卵泡發(fā)育中的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究通過克隆測(cè)序的方法，檢測(cè)到雞CCT6A5'調(diào)控區(qū)存在兩個(gè)突變，即g.-2215T＞C和g.-1959T＞C。分析了兩突變位點(diǎn)在新楊褐、海蘭褐、文昌雞、壽光雞和魯禽五個(gè)雞品種中的基因型和等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)g.-2215T＞C位點(diǎn)，海蘭褐和魯禽中T等位基因的頻率顯著高于新楊褐、文昌雞和壽光雞，并且新楊褐、海蘭褐和文昌雞不符合哈代溫伯格平衡;g.-1959

5、T＞C位點(diǎn)，新楊褐和海蘭褐中C等位基因頻率顯著高于魯禽、壽光雞和文昌雞，且新楊褐群體在兩突變位點(diǎn)偏離哈代溫伯格平衡。兩突變位點(diǎn)單倍型分析得到A、B、C和D四種單倍型，其中A(C-2215-T-1959)、C(T-2215-T-1959)和D(T-2215-C-1959)單倍型為優(yōu)勢(shì)單倍型，性狀關(guān)聯(lián)分析表明AD基因型與高產(chǎn)蛋量(E28)性狀相關(guān)(P＜0.05);AD基因型的個(gè)體F1、F5和POF1卵泡中CCT6A的mRNA表達(dá)水平均最高(