CYP21基因啟動子區(qū)功能和部分編碼區(qū)突變的研究.pdf

1、上海第二醫(yī)科大學博士學位論文CYP21基因啟動子區(qū)功能和部分編碼區(qū)突變的研究姓名：韓蓓申請學位級別：博士專業(yè)：兒科學指導教師：陳瑞冠2003.1.1子突變F306Int和第lO外顯子突變P453S進行檢測；2)進行CYP21基因和TNXA基因擴增，TaqI酶切，向上延伸進行CYP21基因和TNXA基因擴增，通過PCR—RFLP方法快速簡便的篩查常見缺失突變。分析缺失和突變與臨床表現型的關系。結果：啟動子研究oCYP2I和pCYP21P載

2、體構建經酶切和測序證實：轉染后，在熒光倒置顯微鏡下首次發(fā)現Yl細胞中出現綠色熒光蛋白的時間陽性對照為3小時，pCYP21為7小時，pCYP2IP與陰性對照未觀測到綠色熒光蛋白。在COS一7細胞系中，出現綠色熒光蛋白的時間陽性對照為5小時，pCYP21為12小時，pCYP21P與陰性對照未觀測到綠色熒光蛋白。激光共聚焦顯微鏡顯示，在Y1細胞和COS一7細胞系中陽性對照綠色熒光蛋白表達強于pCYP21，陽性對照和pCYP21的綠色熒光蛋白在

3、胞核中的熒光強度高于胞漿。圖象分析顯示：在Yl細胞中，多數細胞GFP胞核熒光強度分布不均勻，有強表達部位，胞核熒光強度強于胞漿：在COS一7細胞中，多數細胞胞核熒光強度分布均勻，少數細胞有強表達部位，胞核熒光強度強于胞漿。上述結果進一步表明，含有CYP21和CYP21P兩種基因啟動子的GFP質粒表達存在顯著差異。編碼區(qū)研究1)2例患者第7外顯子PCR—SSCP存在異常條帶，患者第10外顯子未見異常條帶，測序證實1例患者第7外顯子存在F3

4、0BInt雜合突變及1786GC雜合突變，該患者同時伴有Q318X雜合突變，屬于復雜突變，臨床表現為失鹽型患者。2)PCRRFLP方法證實2例患者存在純合缺失突變，且均為失鹽型患者。結論：啟動子研究1)通過構建CYP21和CYP21PEGFP真核表達載體，建立倒置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡定位、定量圖像分析系統(tǒng)分析等方法，明確了CYP2l和CYP21P基因啟動子一770bp～一lbp區(qū)域在Yl和COS一7細胞系的表達模式存在差異。編碼

5、區(qū)研究1)在中國CAH患者中存在CYP21基因F306Int突變，突變頻率為094％(1／106)。該例患者外顯子7伴有1786G—C雜合突變和外顯子8Q318X雜合突變，屬于復合突變，臨床表現為失鹽型。2)采用CYP21基因和TNXA基因擴增的結果表明中國CAH患者中存在CYP21基因缺失突變，53例患者中2例患者存在基因純合缺失。缺失頻率為377％(2／53)。2例患者均表現為失鹽型。關鍵詞：CYP21基因CYP21P基因啟動子編碼