miR-9、EPAC調(diào)控突觸可塑性的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、背景:MicroRNA（miRNA）是調(diào)控型小分子非編碼RNA，miRNA與其靶分子以及調(diào)控其自身表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子組成了一個復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激等重要生命過程的調(diào)控。miR-9是腦內(nèi)富集型miRNA，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中不僅能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育和分化，而且還參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突生長、分支以及定向。miR-9的異常表達(dá)與認(rèn)知功能障礙疾病密切相關(guān)，研究人員發(fā)現(xiàn)在阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease, AD

2、）病程早期，顳葉皮層內(nèi)miR-9的水平增高，抑制靶基因SIRT1（sirtuin1）阻止神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白tau過度磷酸化來發(fā)揮保護(hù)機(jī)制；而在病程晚期，由于β-淀粉樣蛋白沉積下調(diào)miR-9水平，導(dǎo)致tau蛋白異常磷酸化，神經(jīng)細(xì)絲聚集進(jìn)而形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTS），NFTS與 AD認(rèn)知功能障礙成正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期在EPAC無效突變（EPAC-/-）小鼠模型中也檢測到前腦miR-9水平明顯降低，這種小鼠與正常對照小鼠相比空間學(xué)習(xí)記憶能

3、力和社交能力均有損傷。這些研究提示我們miR-9水平降低可能會影響學(xué)習(xí)記憶功能。突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶神經(jīng)環(huán)路的重要基礎(chǔ)，miR-9水平降低是否也會損傷到突觸可塑性？目前對miR-9影響突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶的分子機(jī)制研究尚不明確。
　　Foxp2基因（Forkhead box protein P2，叉頭框P2基因)是人類發(fā)現(xiàn)的第一個語言相關(guān)基因，廣泛分布于大腦，并且具有多重miRNA結(jié)合位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)Foxp2對語言基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)

4、的調(diào)控路徑，也會影響人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。Foxp2作為細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子發(fā)揮著重要的基因調(diào)控功能，其中很多靶基因?qū)τ谕挥|可塑性如神經(jīng)軸突的生長、樹突的重構(gòu)、神經(jīng)傳遞等起到關(guān)鍵性作用。生物學(xué)信息技術(shù)預(yù)測Foxp2基因是miR-9的靶基因，但miR-9是否通過負(fù)性調(diào)控Foxp2影響突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶功能尚不明確。
　　目的:1.確定miR-9和Foxp2之間的靶向調(diào)控關(guān)系。
　　2.明確miR-9是否通過負(fù)性調(diào)控Fox

5、p2影響突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶功能。
　　方法:采用側(cè)腦室立體定位注射鎖核苷酸修飾的反義寡核苷酸分子 LNA-miR-9抑制C57BL/6成年雄性小鼠腦內(nèi)miR-9水平；Morris水迷宮檢測小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力；條件性恐懼實(shí)驗(yàn)檢測小鼠情緒記憶能力；構(gòu)建過表達(dá)miR-9的重組質(zhì)粒；分別用重組質(zhì)粒和LNA-miR-9轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞獲得miR-9過表達(dá)和miR-9抑制的表型細(xì)胞；采用實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-9和Foxp2 m

6、RNA水平；采用免疫組化檢測Foxp2蛋白在全腦分布；采用膜片鉗電生理技術(shù)檢測突觸傳遞可塑性；采用高爾基染色檢測突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)可塑性；采用免疫印跡檢測 Foxp2蛋白和突觸相關(guān)蛋白的水平；采用RNAi技術(shù)沉默腦內(nèi)Foxp2蛋白水平。
　　結(jié)果:1. miR-9靶向調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子Foxp2
　　體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中我們構(gòu)建了過表達(dá)miR-9的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，獲得miR-9過表達(dá)的表型細(xì)胞。同樣通過轉(zhuǎn)染將LNA-miR

7、-9導(dǎo)入HEK293細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生miR-9抑制的表型細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后實(shí)時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-9水平，72h后免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞Foxp2蛋白水平。結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-9會降低Foxp2蛋白水平，而抑制miR-9則增高Foxp2蛋白水平。動物實(shí)驗(yàn)中我們通過側(cè)腦室立體定位注射將LNA-miR-9導(dǎo)入C57成年小鼠全腦，分別檢測腦內(nèi)海馬和皮層細(xì)胞中Foxp2蛋白水平，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-9后海馬和皮層Foxp2蛋白水平明

8、顯增高，同時我們也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和小鼠海馬和皮層細(xì)胞的Foxp2 mRNA水平都沒有發(fā)生變化。以上結(jié)果說明miR-9和Foxp2之間存在直接的靶向調(diào)控關(guān)系，這種調(diào)控作用可能是通過轉(zhuǎn)錄后翻譯機(jī)制而不是促使Foxp2 mRNA的降解來完成。
　　2.下調(diào)C57成年小鼠腦內(nèi)miR-9水平損傷其空間學(xué)習(xí)記憶及情緒記憶能力
　　腦內(nèi)下調(diào)miR-9水平后我們用Morris水迷宮檢測C57成年小鼠空間學(xué)習(xí)記憶，選擇條件性恐懼實(shí)驗(yàn)檢測海馬依賴

9、性及非海馬依賴性恐懼記憶。結(jié)果顯示miR-9下調(diào)小鼠在水迷宮定位航行訓(xùn)練中潛伏期明顯延長，在空間探索檢測中小鼠在目標(biāo)象限停留時間縮短，穿梭原平臺位置的次數(shù)顯著減少；條件性恐懼實(shí)驗(yàn)中miR-9下調(diào)小鼠在場景條件恐懼和聲音條件恐懼檢測中的僵直時間百分比均有增強(qiáng)。因此抑制腦內(nèi)內(nèi)源性miR-9水平明顯誘導(dǎo)C57成年小鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷及海馬依賴性和皮層依賴性恐懼記憶障礙。
　　3.下調(diào)C57成年小鼠腦內(nèi)miR-9水平損傷突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)和傳遞

10、功能可塑性
　　動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后采用高爾基染色比較并分析小鼠海馬 C A1區(qū)錐體神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元樹突棘密度和蘑菇型樹突棘比例的變化。我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-9明顯降低海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元的樹突棘密度，抑制蘑菇型樹突棘（“記憶型”樹突棘）形成；用電生理膜片鉗技術(shù)記錄海馬CA3-CA1環(huán)路的LTP，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-9明顯抑制LTP的誘導(dǎo)和維持；免疫印跡檢測突觸相關(guān)蛋白的水平變化，發(fā)現(xiàn)突觸小體相關(guān)蛋白SNAP-25及突觸后谷

11、氨酸受體NR1、NR2A、NR2B、GluR1亞基和支架蛋白PSD-95水平均有不同程度的降低。以上結(jié)果說明下調(diào)miR-9損傷C57成年小鼠海馬和皮層突觸的形態(tài)結(jié)構(gòu)和傳遞功能可塑性。
　　4.沉默F(xiàn)oxp2逆轉(zhuǎn)miR-9抑制表型所致空間學(xué)習(xí)記憶和情緒記憶能力的損傷
　　我們在C57成年小鼠腦內(nèi)抑制內(nèi)源性 miR-9水平后再采用 RNAi技術(shù)沉默腦內(nèi)Foxp2基因，然后檢測小鼠空間學(xué)習(xí)記憶和情緒記憶能力的變化。水迷宮和條件性恐

12、懼實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與miR-9下調(diào)小鼠相比，在miR-9抑制表型小鼠腦內(nèi)沉默F(xiàn)oxp2后，小鼠在水迷宮定位航行訓(xùn)練中潛伏期縮短，在空間探索檢測中目標(biāo)象限停留時間延長，穿梭原平臺位置的次數(shù)也增多；條件性恐懼實(shí)驗(yàn)中小鼠在場景條件恐懼和聲音條件恐懼檢測時僵直行為恢復(fù)正常。因此下調(diào)miR-9所致空間學(xué)習(xí)記憶和情緒記憶障礙能夠被沉默F(xiàn)oxp2所逆轉(zhuǎn)。
　　5.沉默F(xiàn)oxp2逆轉(zhuǎn)miR-9抑制表型所致突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能可塑性的改變
　　沉

13、默F(xiàn)oxp2逆轉(zhuǎn)miR-9抑制表型的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，我們用高爾基染色統(tǒng)計分析海馬 C A1區(qū)錐體神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元的樹突棘密度及蘑菇型樹突棘的比例，發(fā)現(xiàn)抑制miR-9水平后下降的樹突棘密度及蘑菇型樹突棘比例在沉默F(xiàn)oxp2后恢復(fù)正常；免疫印跡檢測海馬和皮層突觸相關(guān)蛋白水平，發(fā)現(xiàn)抑制miR-9所致海馬和皮層突觸小體相關(guān)蛋白SNAP-25及突觸后谷氨酸受體NR1、NR2A、NR2B、GluR1亞基和支架蛋白PSD-95水平的降低也能被沉默 F

14、oxp2所逆轉(zhuǎn)；沉默F(xiàn)oxp2同樣能夠改善抑制miR-9后所致海馬CA3-CA1環(huán)路LTP的損傷，因此沉默F(xiàn)oxp2能夠逆轉(zhuǎn)miR-9抑制表型所致突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能可塑性的改變。
　　結(jié)論:本課題研究從基因表達(dá)與基因功能兩層面證實(shí)miR-9與核轉(zhuǎn)錄因子Foxp2之間存在直接靶向調(diào)控關(guān)系。下調(diào) miR-9減少海馬 CA1區(qū)錐體神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元的樹突棘密度及蘑菇型樹突棘的比例；降低海馬和皮層突觸相關(guān)蛋白水平；損傷海馬CA3-CA1環(huán)