水包油包納米粒亞微乳劑的研究.pdf

1、增加難溶性藥物的溶解度是藥劑學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，而油水均不溶性藥物給藥系統(tǒng)的研究更是其中的難點(diǎn)問(wèn)題。本課題將納米粒和水包油（O/W）亞微乳相結(jié)合，制成新型的水包油包納米粒（N/O/W）亞微乳給藥系統(tǒng)，將納米粒包載在亞微乳的油相中，以達(dá)到增加制劑中難溶性藥物載藥量的目的。制劑中采用生物相容性好的輔料，安全性好，可實(shí)現(xiàn)難溶性藥物的靜脈注射給藥。N/O/W亞微乳可進(jìn)一步制成干乳劑，提高穩(wěn)定性不好的藥物在制劑中的穩(wěn)定性。雙氫青蒿素（Dihydro

2、artemisinin，DHA）是青蒿素經(jīng)還原而成的半縮醛化合物，具有良好的抗瘧作用，近代研究表明DHA對(duì)多種人類和動(dòng)物腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用，且治療濃度下對(duì)正常細(xì)胞幾乎無(wú)毒性作用，有希望發(fā)展成為新型的抗腫瘤藥物。DHA為難洛性藥物，分子結(jié)構(gòu)中存在特殊的過(guò)氧基團(tuán)，穩(wěn)定性差，胃腸道降解嚴(yán)重，生物利用度低。本研究以雙氫青蒿素為模型藥物，采用生物相容性好的輔料制備了注射用DHA N/O/W亞微乳劑，可實(shí)現(xiàn)DHA的靜脈注射給藥。同時(shí)針對(duì)DHA穩(wěn)定

3、性不好的特點(diǎn)，進(jìn)一步制成千乳劑，提高DHA在制劑中的穩(wěn)定性。 本課題建立了DHA的HPLC含量測(cè)定法，考察了DHA在溶液中異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化平衡情況，α-DHA與β-DHA在溶液中達(dá)到平衡所需時(shí)間約為10h，平衡后二者的比例不再變化，比例約為2．3（α/β）。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中DHA異構(gòu)體總峰面積基本保持恒定，對(duì)DHA的HPLC分析可用α-DHA與β-DHA峰面積之和與濃度進(jìn)行線性回歸，計(jì)算DHA的含量。測(cè)定了DHA在不同溶媒中的溶解度，D

4、HA在水和大豆油中的表觀溶解度分別為0．119±0．021和1．24±0．01mg/mL，在水和大豆油中加入不同乳化劑后，均能提高DHA的溶解度，其中以大豆油/大豆磷脂/膽固醇最為顯著。 以注射用大豆油、大豆磷脂、膽固醇和穩(wěn)定劑C為油相，Poloxamer188、甘油為水相，采用微射流技術(shù)制備DHA N/O/W亞微乳。乳劑外觀為乳白色液體，無(wú)油花，不掛壁，用水稀釋后有淡藍(lán)色乳光。平均粒徑為152±18nm（PDI0．078±0．

5、018），Zeta電位為-33．28±2．07mV，pH值為7．18±0．03，符合注射要求。DHA N/O/W亞微乳中藥物含量為2．98±0．03mg/mL，載藥量約為DHA O/W亞微乳最高載藥量的3倍。以DHA O/W亞微乳作為對(duì)照，分別在光學(xué)顯微鏡、透射電鏡、冷凍蝕刻透射電鏡下觀察不同粒徑DHA N/O/W亞微乳的形態(tài)。結(jié)果顯示，DHAN/O/W亞微乳呈橢圓狀，邊緣光滑，乳滴大小較均勻，乳滴中包含有顆粒狀物質(zhì)，DHA O/W亞微

6、乳中則未觀察到有顆粒狀物質(zhì)存在。冷凍蝕刻透射電鏡可見(jiàn)DHA N/O/W亞微乳乳滴斷面不平整，具有類似于層紋或殼狀的結(jié)構(gòu)存在，而DHA O/W亞微乳的乳滴斷面較光滑平坦。以多種可代表DHA納米粒不同狀態(tài)的DHA制劑和DHA純品為對(duì)照，進(jìn)行DHA N/O/W亞微乳的DSC分析試驗(yàn)。與DHA純品相比，DHA N/O/W亞微乳劑和DHA油混懸液中DHA的熔點(diǎn)下降了接近10℃。而DHA水混懸液和模擬DHA分散在N/O/W亞微乳水相的制劑中DHA熔

7、點(diǎn)與DHA純品的熔點(diǎn)相近。通過(guò)DHA的熔點(diǎn)變化情況判斷，DHA N/O/W亞微乳劑中DHA的存在位置應(yīng)在制劑的油相中，與顯微鏡的結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果相符。 考察了DHA在N/O/W亞微乳中的分布情況。經(jīng)測(cè)定DHA N/O/W亞微乳劑約有8．06％的藥物溶解在水相中，91．9％的藥物存在在油相中。其中有13．8％的藥物溶解在油相中，其余78．1％的DHA存在于界面膜和油相的納米粒中。 以甘露醇：蔗糖（4：1）為凍干保護(hù)劑制備了DH

8、A N/O/W干乳劑，干乳中凍干保護(hù)劑與油相的比例為2：1（w/w）。凍干過(guò)程為DHA N/O/W亞微乳與凍干保護(hù)劑混合均勻后，在-40℃迅速冷卻預(yù)凍6小時(shí)，然后在-40℃真空干燥4小時(shí)，-40℃-0℃真空干燥8小時(shí)，升溫至20℃持續(xù)4小時(shí)去除殘余水分，凍干過(guò)程中壓力保持在30-50mTorr，冷凝器溫度控制在-80℃。 建立了DHA有關(guān)物質(zhì)的HPLC分析法，采用強(qiáng)制破壞法制備了在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、光照、高溫和氧化條件下破壞的樣品，找

9、到了7個(gè)DHA的降解產(chǎn)物。DHA的降解產(chǎn)物在本分析方法下均能達(dá)到良好分離，本法可用于DHA制劑的穩(wěn)定性研究。 考察了DHA、DHA N/O/W亞微乳劑和DHA N/O/W干乳劑的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，DHA對(duì)光照和高溫敏感，在濕度較高的環(huán)境下含量也有改變，故應(yīng)低溫干燥避光保存?？疾炝薉HA在溶液中的穩(wěn)定情況。與DHA溶液相比，DHA N/O/W亞微乳的穩(wěn)定性已有提高，但對(duì)溫度仍然很敏感，在光照條件下不穩(wěn)定。DHAN/O/W亞微乳需放

10、置在4℃，充氮避光密閉保存．對(duì)DHA N/O/W干乳劑進(jìn)行了加速試驗(yàn)和長(zhǎng)期留樣觀察。DHA N/O/W干乳經(jīng)25℃、60％ RH加速試驗(yàn)6個(gè)月，含量下降4％，復(fù)溶時(shí)間略微延長(zhǎng)，粒徑分布、Zeta電位和pH值沒(méi)有顯著變化。4℃長(zhǎng)期留樣觀察9個(gè)月內(nèi)制劑性狀、藥物含量等均無(wú)明顯變化。在此條件下DHAN/O/W干乳劑質(zhì)量穩(wěn)定，長(zhǎng)期試驗(yàn)仍在進(jìn)行中。 通過(guò)異常毒性檢查、血管刺激性試驗(yàn)以及溶血性試驗(yàn)對(duì)DHA N/O/W亞微乳劑的安全性進(jìn)行了初

11、步評(píng)價(jià)。DHA N/O/W亞微乳劑對(duì)小鼠的異常毒性試驗(yàn)合格，制劑在生產(chǎn)過(guò)程中未帶來(lái)異常的毒性。對(duì)家兔耳緣靜脈無(wú)明顯刺激作用，對(duì)家兔紅細(xì)胞無(wú)明顯體外溶血及致凝集作用，DHA N/O/W亞微乳劑用于靜脈注射是安全的。 建立了體內(nèi)樣品中DHA含量測(cè)定的HPLC-MS分析方法。方法專屬性好，內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾，樣品處理簡(jiǎn)單，精密度、回收率均符合規(guī)定，可用于DHA的體內(nèi)分析。以DHA和DHA O/W亞微乳劑為對(duì)照，考察了DHA N

12、/O/W亞微乳劑與家兔、大鼠和人血漿的血漿蛋白結(jié)合情況。在本試驗(yàn)研究的濃度范圍內(nèi)，不同濃度的DHA制劑在同種血漿中的蛋白結(jié)合率無(wú)顯著差異，蛋白結(jié)合率與藥物濃度無(wú)關(guān)。不同制劑在同種血漿中的蛋白結(jié)合率也沒(méi)有顯著差異。不同種血漿當(dāng)中，DHA與家兔的血漿蛋白結(jié)合率較高，其次為大鼠和人的，DHA與血漿蛋白具有中等強(qiáng)度的結(jié)合，平均血漿蛋白結(jié)合率分別76．36％、66．34％和63．94％。 家兔體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示，DHA N/O/W亞微

13、乳和DHA O/W亞微乳可以顯著延長(zhǎng)DHA的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，提高血漿中藥物濃度。DHA N/O/W亞微乳和DHA O/W亞微乳的MRT分別為DHA溶液劑的的10．39和3．42倍，DHAN/O/W亞微乳為DHA O/W亞微乳的3．03倍。DHA N/O/W亞微乳和DHA O/W亞微乳的AUC分別為DHA溶液劑的3．01和1．80倍，DHA N/O/W亞微乳為DHAO/W亞微乳的1．67倍。小鼠組織分布研究表明，DHA在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化成一未知

14、成分，在血液樣品中可觀察到轉(zhuǎn)變情況，各組織中僅檢測(cè)到該成分的存在。經(jīng)固相萃取分離提取，HPLC-MS分析得到該成分的質(zhì)譜圖，該成分具有m/z267．1的碎片離子峰提示其結(jié)構(gòu)中仍有過(guò)氧基團(tuán)的存在，應(yīng)仍具有與DHA類似的藥效?？疾炝嗽摮煞衷谛∈篌w內(nèi)的消除分布規(guī)律，研究DHA N/O/W亞微乳劑的組織分布趨勢(shì)。結(jié)果表明，DHA亞微乳劑可延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)組織臟器中的滯留時(shí)間，在肝的攝取最高。DHA N/O/W亞微乳劑和DHA O/W亞微乳劑的體內(nèi)

15、分布趨勢(shì)有所不同，DHA N/O/W亞微乳劑在心臟的分布降低，而在血中的滯留時(shí)間和在胃、腦中的分布增加。 以H22荷瘤小鼠模型進(jìn)行DHA N/O/W亞微乳劑抗腫瘤藥效學(xué)的研究。乳劑給藥劑量為45mg/kg時(shí)，抑瘤率達(dá)51．8％（P<0．01），給藥劑量為11．25mg/kg時(shí)，抑瘤率為23．0％，低劑量乳劑組藥效略高于同等劑量的溶液組，高劑量的溶液對(duì)照組給藥后溶媒毒性超過(guò)了動(dòng)物的耐受劑量，因此未得到高劑量溶液組的數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，

16、45mg/kg的DHA N/O/W亞微乳劑對(duì)H22腫瘤細(xì)胞具有顯著抑制效果。對(duì)小鼠腫瘤的免疫組化結(jié)果分析表明，DHA可下調(diào)VEGF的表達(dá)，高劑量乳劑組尤為明顯，對(duì)各組組織切片的MVD觀察結(jié)果表明，MVD與VEGF表達(dá)結(jié)果趨勢(shì)相同，DHA可能是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的血管生成來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。 通過(guò)DHA N/O/W亞微乳的處方與工藝篩選、制劑特征、穩(wěn)定性、安全性考察，動(dòng)物組織分布、體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)、以及抗腫瘤作用的研究，表明N/O/W亞

17、微乳具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）可提高油水均不溶性藥物的載藥量；（2）使用生物相容性好的輔料，制劑安全性好，可適用于靜脈注射給藥；（3）以亞微乳作為納米粒的載體，可增加納米制劑的物理穩(wěn)定性；（4）可進(jìn)一步制成千乳劑，增加不穩(wěn)定藥物的化學(xué)穩(wěn)定性；（5）能夠改變藥物在體內(nèi)的組織分布和藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，有可能進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成靶向制劑；（6）易于工業(yè)化生產(chǎn)。本課題為N/O/W亞微乳新劑型的研究奠定了基礎(chǔ)，為難溶性藥物給藥系統(tǒng)的研發(fā)提供新思路。DHA N/O/