Nifedipine調(diào)節(jié)白皮松(Pinus bungeana)花粉管蛋白質(zhì)表達及其對細胞壁構(gòu)建的影響.pdf

1、花粉管是種子植物受精過程中的雄性生殖單位的載體，由于其生長依賴于胞內(nèi)Ca2+梯度，并具有典型的頂端極性生長的特點，因而成為近年來研究植物細胞相互識別、胞內(nèi)和胞外信號傳導(dǎo)理想的模式系統(tǒng)。裸子植物花粉與被子植物相比具有萌發(fā)時間長、生長緩慢等特點。Ca2+在裸子植物花粉萌發(fā)和花粉管生長中的作用機制目前尚不明確。本研究以裸子植物白皮松(Pinus bungeana)的花粉為材料，運用不同濃度鈣通道抑制劑Nifedipine(Nif)處理，對其花

2、粉萌發(fā)和花粉管生長進行了細胞學研究和蛋白質(zhì)組學分析，以探討Ca2+對白皮松花粉生長的調(diào)控機制，為進一步揭示裸子植物花粉萌發(fā)和花粉管生長機理提供參考。
　　 本論文首先研究了鈣通道抑制劑Nif和Ca2+螯合劑EGTA對白皮松花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響。結(jié)果表明，用Nif處理花粉后，花粉萌發(fā)和花粉管生長均受到明顯抑制。經(jīng)Ca2+熒光探針Fluo-3AM標記，對Nif處理后Ca2+在花粉管中的分布模式進行了觀察，發(fā)現(xiàn)Ca2+在正常生長

3、的花粉管中呈梯度分布，并在其頂端的熒光最強。與對照相比，處理后的花粉管熒光強度明顯減弱，且頂端Ca2+梯度消失。通過EGTA漂洗后的花粉粒，在正常培養(yǎng)基上萌發(fā)率較高，但其生長速率受到抑制。由此說明了細胞壁鈣庫對花粉管生長的抑制效應(yīng)顯著高于對花粉萌發(fā)的影響，是花粉管生長的限速因子。同時外加鈣調(diào)素還可逆轉(zhuǎn)EGTA對其花粉萌發(fā)和花粉管生長的抑制。上述結(jié)果表明，白皮松花粉萌發(fā)及花粉管生長需要外源Ca2+的內(nèi)流，以及胞內(nèi)形成的Ca2+濃度梯度。<

4、br>　　 用FM4-64探針標記結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正?；ǚ酃苤械陌套饔弥饕l(fā)生在頂端和亞頂端區(qū)域，胞吞的小泡也集中分布在這兩個區(qū)域。經(jīng)Nif處理后，既不影響花粉管的胞吞過程，同時胞吞發(fā)生的位置也與對照相似，只是胞吞的小泡分散于整個花粉管中。電子顯微鏡觀察表明，各種細胞器在白皮松正常生長的花粉管中分布與被子植物存在較大差異，例如前者無明顯地分區(qū)現(xiàn)象，不具胼胝質(zhì)塞。白皮松花粉管頂端和亞項端的壁旁體與質(zhì)膜融合現(xiàn)象頻繁發(fā)生?；ǚ酃芙?jīng)Nif處理后，

5、線粒體出現(xiàn)不同程度的解體和液泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)液泡化和核糖體脫落，液泡大量聚集在花粉管頂端，壁旁體與膜融合現(xiàn)象減少，以及花粉管壁明顯變薄等。此外，通過微絲特異性探針鬼筆環(huán)肽標記結(jié)果表明，正常生長花粉管的微絲呈長軸向排列， Nif處理后微絲斷裂，其斷裂程度與處理濃度有關(guān)。由此可見，外源Ca2+對花粉管的胞吞無明顯抑制或促進作用，但對胞吞小泡重回收可能有影響。當胞內(nèi)Ca2+梯度消失后，則明顯抑制了微絲骨架的聚合，進而使胞吐作用減緩，高爾基體分泌小

6、泡聚集，多種細胞器液泡化，引起花粉管頂端膨大，細胞壁變薄，繼而抑制花粉管的正常生長。
　　 運用免疫熒光標記技術(shù)顯示，正常生長的花粉管壁含有纖維素、胼胝質(zhì)、果膠質(zhì)和阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)，其中纖維素和胼胝質(zhì)在細胞壁上呈均勻分布，而酸性果膠質(zhì)只存在花粉管兩側(cè)壁上，酯化果膠分布于花粉管頂端。經(jīng)過Nif處理后，胼胝質(zhì)和酸性果膠質(zhì)均在花粉管頂端累積，而AGPs和纖維素的分布卻無明顯變化。另外，傅里葉紅外光譜分析結(jié)果也同樣支持上述

7、結(jié)論。通過花粉管壁蛋白的SDS-PAGE分析表明，Nif對細胞壁蛋白的合成也有較大的影響。
　　 在花粉管的鈣通道受到抑制后，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析其蛋白質(zhì)的表達圖譜，通過雙向電泳己分離出約1000個蛋白質(zhì)斑點，經(jīng)軟件分析發(fā)現(xiàn)，除其中50個蛋白斑點外，大部分蛋白質(zhì)的表達量均未發(fā)生變化。上述50個發(fā)生變化的蛋白斑點酶切后，再經(jīng)過ESI-MS/MS鑒定和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的搜索，共鑒定出28個蛋白，其中12個為上調(diào)蛋白，16個下調(diào)蛋白，根據(jù)

8、其主要功能分為與代謝、細胞擴展、翻譯后修飾以及信號相關(guān)的蛋白。經(jīng)過Nif處理后，花粉管中碳水化合物代謝能力下降，ATP的產(chǎn)生受到抑制，參與細胞壁多糖合成及小泡運輸?shù)牡鞍?，如valosin containing protein(VCP)、reversibly glycolsylated polypeptide(RGP)、UDP-glucose dehydrogenase(UDPGDH)和α-tubulin表達下調(diào)。另外，通過上述方法還鑒定