犬瘟熱病毒的分離及主要蛋白基因序列分析.pdf

1、犬瘟熱(Caninedistemper,CD)的病原是犬瘟熱病毒(CaninedistempervirusCDV)，該病以雙相熱、急性鼻卡他、結(jié)膜炎、嚴重的胃腸炎和神經(jīng)癥狀為特征。發(fā)病率和死亡率較高，給養(yǎng)犬業(yè)和毛皮動物飼養(yǎng)業(yè)帶來極大的危害，加強本病的預防免疫極為重要，因此采用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)基因工程疫苗有重要意義。本文成功分離了一株犬瘟熱病毒并進行了主要蛋白基因序列分析，為構(gòu)建新型基因工程疫苗奠定基礎。
　　 本文通過對從20

2、09-2011年山東部分地區(qū)疑似犬瘟熱的犬、貉、貂和狐貍臨床癥狀和病理變化進行研究，探討犬瘟熱的臨床癥狀和病變特點，并進行流行病學調(diào)查。研究發(fā)現(xiàn)近幾年患病犬、貉、貂和狐貍臨床癥狀出現(xiàn)新的變化，足墊的角質(zhì)化、皮膚病變現(xiàn)象逐漸減少，后肢癱瘓癥狀增多。廣泛性出血，缺乏特征性病變。發(fā)病急、死亡率高。一年四季都有發(fā)生。
　　 采用Vero細胞從臨床疑似患犬瘟熱的犬組織病料中分離出一株病毒，通過觀察細胞病變，間接免疫熒光，提取細胞培養(yǎng)物RN

3、A并擴增克隆分析N蛋白基因部分序列進行了鑒定。結(jié)果表明:該毒株接種于Vero細胞后，出現(xiàn)了典型的細胞病變;間接免疫熒光試驗表明接種病毒的BHK-21細胞出現(xiàn)特異性的亮綠色熒光，而正常細胞則未見綠色熒光;對接種病料后的Vero細胞培養(yǎng)物提取總RNA進行RT-PCR擴增，得到了287bp的目的片段;序列分析表明該分離株與犬瘟熱病毒弱毒(Onderstepoort、CDV3、recombinantSnyderHill等)的同源性較低為95.8

4、％-97.2％，與標準強毒株(A75/17和2544/Han95)以及野毒株(xJ-4、ZJ7、98-2646等)的同源性較高為97.6％-99.3％,證明該毒株為犬瘟熱病毒野毒株，命名為SD10。
　　 根據(jù)Genbank上已發(fā)表犬瘟熱病毒Onderstepoort(AF305419)株設計引物，參考有關文獻合成9對引物，應用RT-PCR技術(shù)，從CDV分離株SD10株的細胞毒中成功擴增出了9段cDNA，將這9段cDNA與pGE

5、M-Teasy載體連接并進行克隆、測序，測得的序列經(jīng)過拼接得到CDV核衣殼蛋白基因N、磷蛋白基因P、基質(zhì)膜蛋白基因M、融合蛋白基因F、血凝素蛋白基因H、大蛋白基因L的全基因序列。將分離株SD10株與22株Genbank上發(fā)表的CDV全基因組參考毒株的6個蛋白全基因核苷酸序列及推導氨基酸序列進行比較分析。分析表明分離株SD10株與疫苗株Onderstepoort(OP)和CDV3親緣關系最遠，屬于強毒株，與中國分離株HLJ1-06、HIJ