豬δ冠狀病毒抑制IFn-β產(chǎn)生的機制研究.pdf

1、豬δ冠狀病毒(PDCoV)屬于冠狀病毒科δ冠狀病毒屬，能造成母豬和仔豬的腹瀉、嘔吐、脫水，嚴(yán)重者可致死。自2014年初美國俄亥俄州的豬場爆發(fā)母豬和仔豬腹瀉病以來，該病毒迅速傳播至美國其它州以及韓國、加拿大和中國大陸，給養(yǎng)豬業(yè)造成了一定的經(jīng)濟損失。
　　干擾素以及干擾素誘導(dǎo)的細胞抗病毒天然免疫應(yīng)答是機體抵抗病毒入侵的重要防御機制。為了抵抗干擾素的抗病毒效應(yīng)，冠狀病毒在其進化過程中能采用不同的策略來逃避宿主的天然免疫反應(yīng)，其中α冠狀病

2、毒、β冠狀病毒以及γ冠狀病毒逃避天然免疫的分子機制已經(jīng)得到廣泛研究，因此我們推測PDCoV也進化出了逃避抗病毒免疫反應(yīng)的策略。為了揭示PDCoV感染與天然免疫之間的關(guān)系及機制，本文對PDCoV感染細胞后干擾素的產(chǎn)生情況及其信號通路展開了研究。具體內(nèi)容如下:
　　1.PDCoV在LLC-PK1細胞上生長特性的研究
　　首先我們研究不同胰酶濃度的培養(yǎng)基對PDCoV引起LLC-PK1細胞病變的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCoV對LLC-PK

3、1細胞的感染需要一定濃度的胰酶，且各時間點出現(xiàn)的病變程度和細胞脫落程度都隨胰酶濃度增加而加大，其中當(dāng)使用胰酶濃度為10ug/mL的培養(yǎng)基時，PDCoV感染的LLC-PK1細胞在24 h開始出現(xiàn)病變，但病變程度輕微，且無細胞脫落;同時我們還研究了PDCoV引起的細胞病變與接種劑量的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCoV引起的LLC-PK1細胞的病變時間與病變程度都隨接種劑量的增加而增大，當(dāng)接種量為0.01 moi時，細胞在24 h開始出現(xiàn)病變，但病變程

4、度輕微，且無細胞脫落，與上述胰酶濃度摸索實驗結(jié)果一致;間接免疫熒光實驗結(jié)果顯示PDCoV感染LLC-PK1細胞后感染率隨時間的推移而增大，在感染24 h后感染率能達到較高水平且無細胞脫落;病毒滴定測定結(jié)果顯示病毒滴度在感染過程中呈現(xiàn)逐步上升趨勢，在感染24 h后病毒滴度能達到107.2 TCID50/mL。因此PDCoV感染LLC-PK1細胞后在24 h能達到較高感染率且無細胞脫落，它將作為我們后續(xù)實驗所選擇的最佳時間點。
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5、.PDCoV感染后IFN-β、NF-κB和IRF3的產(chǎn)生情況研究
　　采用IFN-β啟動子的熒光素酶報告系統(tǒng)檢測PDCoV感染LLC-PK1細胞之后IFN-β的表達情況，實驗結(jié)果顯示PDCoV感染不僅不能激活I(lǐng)FN-β的轉(zhuǎn)錄，并且還能抑制SeV或poly(I∶C)誘導(dǎo)的IFN-β的轉(zhuǎn)錄，且呈現(xiàn)PDCoV接種劑量依賴性;進一步采用NF-κB和IRF3啟動子的熒光素酶報告系統(tǒng)檢測PDCoV感染LLC-PK1細胞之后NF-κB和IRF3

6、的表達情況，實驗結(jié)果顯示PDCoV感染不能激活NF-κB和IRF3的啟動子活性，并且還能抑制SeV或poly(I∶C)誘導(dǎo)的NF-κB啟動子活性和IRF3啟動子活性。該結(jié)果表明PDCoV能通過抑制NF-κB和IRF3轉(zhuǎn)錄因子的活性從而抑制IFN-β啟動子的活性。
　　3.PDCoV抑制IFN-β產(chǎn)生的信號通路研究
　　SeV和poly(I∶C)是RIG-I樣受體介導(dǎo)的IFN-β信號通路中的關(guān)鍵誘導(dǎo)物，因此我們推測PDCoV抑

7、制SeV或poly(I∶C)誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生很有可能是通過阻斷了RIG-I信號通路上的某個信號分子。為了驗證這種可能性及其分子機制，我們研究鑒定了PDCoV阻斷SeV或poly(I∶C)誘導(dǎo)的IFN-β轉(zhuǎn)錄的靶蛋白。在RIG-I信號通路的分析中，通過對RIG-I、RIG-IN、MDA5、IPS-1、TBK1、IKKε、IRF3和IRF3(5D)的超表達分析，我們發(fā)現(xiàn)PDCoV感染能抑制IRF3及其上游信號分子(RIG-I/RIG-I

8、N、MDA-5、IPS-1、TBK1和IKKε)誘導(dǎo)的IFN-β啟動子活性，但不會影響IRF3的組成激活型IRF3(5D)激活的IFN-β啟動子活性，表明PDCoV能夠靶向IRF3阻斷RIG-I信號通路，從而抑制IFN-β的轉(zhuǎn)錄。
　　4.PDCoV感染后IRF3和P65的磷酸化與核轉(zhuǎn)位研究
　　PDCoV能夠抑制SeV誘導(dǎo)的IRF3和NF-κB的啟動子活性，而磷酸化與核轉(zhuǎn)位是IRF3和NF-κB(P65)活化的標(biāo)志，因此我