外周血中NK和Treg細(xì)胞的數(shù)目和功能變化對(duì)供精人工授精不良結(jié)局的影響.pdf

1、供精人工授精術(shù)（Artificial insemination with donor sperm，AID）作為治療男性因素引起的不孕癥的一線(xiàn)輔助生殖技術(shù)已在全球范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用。但其周期妊娠率不足20％，分娩活產(chǎn)率不足13％，導(dǎo)致大多數(shù)接受AID治療的婦女經(jīng)歷反復(fù)授精失敗、生化妊娠與胚胎停育或自然流產(chǎn)等不良結(jié)局，嚴(yán)重影響她們的身心健康，同時(shí)制約了AID的發(fā)展。目前AID不良結(jié)局發(fā)生的原因尚未完全明確。
　　 大量研究表明自然殺傷（

2、Nature killer，NK）細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T（Regulatory T，Treg）細(xì)胞在正常妊娠的維持中發(fā)揮重要作用，其數(shù)目和/或功能失調(diào)與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、原發(fā)性不孕及子癇前期等生殖病理性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。最新研究顯示，NK、Treg細(xì)胞還與體外受精技術(shù)（In-vitro fertilization，IVF）中胚胎反復(fù)植入失敗的發(fā)生有關(guān)。此外，某些NK與Treg細(xì)胞參數(shù)在生殖失敗人群中可用于預(yù)測(cè)下次妊娠結(jié)局。但二者在除IVF外其它輔助

3、生殖技術(shù)所致的生殖失敗，如AID不良結(jié)局中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本研究通過(guò)比較發(fā)生了AID不良結(jié)局的婦女與正常生育婦女未孕期外周血NK、Treg細(xì)胞的數(shù)目與功能變化，探討NK與Treg細(xì)胞對(duì)AID不良結(jié)局發(fā)生的影響。此外，利用受試者工作特征曲線(xiàn)（Receiver operating characteristic curve，ROC曲線(xiàn)）評(píng)價(jià)NK與Treg細(xì)胞數(shù)目、功能參數(shù)對(duì)AID不良結(jié)局發(fā)生的預(yù)測(cè)能力，篩選最佳預(yù)測(cè)指標(biāo)，確定

4、臨界值，從而為發(fā)生AID不良結(jié)局高危人群的早期篩查及臨床干預(yù)提供依據(jù)。
　　 第一部分供精人工授精不良結(jié)局婦女外周血中NK細(xì)胞數(shù)目和功能的變化
　　 目的：探討外周血中NK細(xì)胞亞群數(shù)目與NK細(xì)胞毒性（NK cell cytotoxicity，NKCC）的變化對(duì)AID不良結(jié)局的影響。
　　 方法：以75例AID不良結(jié)局婦女為病例組，其中，實(shí)施≥4次AID均失敗的對(duì)象25例（組Ⅰ），發(fā)生生化妊娠對(duì)象25例（組Ⅱ），實(shí)

5、施AID后妊娠12周內(nèi)曾發(fā)生胚胎停止發(fā)育或自然流產(chǎn)對(duì)象25例（組Ⅲ），以20例成功生育一次的健康婦女為對(duì)照組。收集所有對(duì)象卵泡末期外周血，采用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，一部分采用三色流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)總淋巴細(xì)胞群中CD56+、CD56+CD16+與CD56+CD16-NK細(xì)胞亞群數(shù)目；另一部分與K562細(xì)胞共培養(yǎng)，采用雙色流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)NKCC。

6、>　　 結(jié)果：與正常對(duì)照相比，組Ⅱ與組Ⅲ的CD56+NK細(xì)胞數(shù)目明顯增加（P＜0.05），AID不良結(jié)局各組CD56+CD16+NK細(xì)胞數(shù)目均顯著升高（P＜0.01），但CD56+CD16-NK細(xì)胞數(shù)目各組間無(wú)差異（P＞0.05）；AID不良結(jié)局各組NKCC較正常對(duì)照升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 結(jié)論：卵泡末期外周血NK細(xì)胞毒性表型數(shù)目增加、NKCC增強(qiáng)影響AID不良結(jié)局的發(fā)生。
　　 第二部分供精

7、人工授精不良結(jié)局婦女外周血中Treg細(xì)胞數(shù)目和功能的變化
　　 目的：探討外周血中Treg細(xì)胞數(shù)目與功能變化對(duì)AID不良結(jié)局的影響。
　　 方法：以60例AID不良結(jié)局婦女為病例組，其中，實(shí)施≥4次AID均失敗的對(duì)象20例（組Ⅰ），發(fā)生生化妊娠對(duì)象20例（組Ⅱ），實(shí)施AID后妊娠12周內(nèi)曾發(fā)生胚胎停止發(fā)育或自然流產(chǎn)對(duì)象20例（組Ⅲ），以20例成功生育一次的健康婦女為正常對(duì)照。收集所有對(duì)象卵泡末期與黃體末期外周血，采用密度

8、梯度離心法分離PBMC，采用三色流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞亞群中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的數(shù)目和CD4+CD25+FOXP3+功能表型的百分比。
　　 結(jié)果：與正常對(duì)照相比，AID不良結(jié)局各組卵泡末期外周血CD4+細(xì)胞群中CD4+CD25+FOXP3+功能表型百分比均顯著減少（P＜0.01），而CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)目各組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；卵泡末期Treg細(xì)胞數(shù)目與自身黃體末期相比，正常對(duì)

9、照組卵泡末期CD4+CD25+FOXP3+功能表型的百分比顯著升高（P＜0.01），而AID不良結(jié)局各組月經(jīng)周期內(nèi)Treg功能表型百分比的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)目在病例組與對(duì)照組月經(jīng)周期內(nèi)的變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：卵泡末期外周血中Treg細(xì)胞功能表型百分比下降與AID不良結(jié)局的發(fā)生有關(guān)；AID不良結(jié)局各組卵泡末期Treg細(xì)胞功能下降可能與月經(jīng)周期中Treg細(xì)胞

10、功能表型擴(kuò)增峰的缺失相關(guān)。
　　 第三部分外周血中NK和Treg細(xì)胞參數(shù)對(duì)AID不良結(jié)局預(yù)測(cè)價(jià)值的研究
　　 目的：評(píng)價(jià)NK與Treg細(xì)胞數(shù)目、功能參數(shù)對(duì)AID不良結(jié)局的預(yù)測(cè)能力，篩選出最佳的預(yù)測(cè)指標(biāo)，確定其臨界值。
　　 方法：基于前兩部分的研究結(jié)果，對(duì)與AID不良結(jié)局發(fā)生相關(guān)的CD56+、CD56+CD16+NK細(xì)胞數(shù)目、NKCC與CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞功能表型百分比進(jìn)行ROC曲線(xiàn)分析，計(jì)

11、算曲線(xiàn)下面積（Area under curve，AUC）與曲線(xiàn)中各點(diǎn)對(duì)應(yīng)的靈敏度與特異度，評(píng)價(jià)各參數(shù)對(duì)AID不良結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值。
　　 結(jié)果v CD56+、CD56+CD16+NK細(xì)胞數(shù)目、NKCC與CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞功能表型百分比的AUC分別為0.76，0.77，0.82與0.77；CD56+NK細(xì)胞數(shù)目＞16％，CD56+CD16+數(shù)目＞12％，NKCC＞10％與CD4+CD25+FOXP3+百分比＜