融合基因CCL21-CD40L對(duì)結(jié)腸癌主動(dòng)免疫的誘導(dǎo).pdf

1、目的： 樹(shù)突狀細(xì)胞是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，能夠捕獲、加工、提呈抗原，啟動(dòng)免疫應(yīng)答，在免疫抗腫瘤方面發(fā)揮舉足輕重的作用。但是由于樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendriticcells，DCs)制備過(guò)程長(zhǎng)、生存期短，體外難以模擬其生理成熟等因素，制約了DC瘤苗的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建攜帶CCL21－linker-exCD40L融合基因的真核表達(dá)載體，通過(guò)融合基因在體內(nèi)腫瘤組織局部表達(dá)，趨化并活化DCs，發(fā)揮抗腫瘤作用。 方法：

2、首先，在GeneBank檢索小鼠CCL21及CD40L基因編碼序列，確定擴(kuò)增區(qū)域，設(shè)計(jì)引物。以Trizol抽提小鼠脾臟總RNA，通過(guò)RT-PCR方法獲得CCL21及exCD40L基因。重疊PCR方法將CCL21分泌型信號(hào)肽(CCL21sig)與exCD40L連接，獲得CCL21sig-exCD40L基因，使得CD40L能夠以分泌形式表達(dá)，與CCL21基因分別作為融合基因的對(duì)照。重疊PCR構(gòu)建CCL21-linker-exCD40L融合基

3、因，將其克隆入T載體進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的融合基因片段連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1。將pcDNA3.1/CCL21-linker-exCD40L質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，WesternBlot法檢測(cè)融合基因蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)。通過(guò)趨化實(shí)驗(yàn)對(duì)融合基因進(jìn)行活性檢測(cè)。構(gòu)建小鼠結(jié)腸癌腫瘤模型，體外轉(zhuǎn)染CCL21-linker-exCD40L真核表達(dá)載體，驗(yàn)證其抗腫瘤作用。 結(jié)果： 通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增約420bp大小的產(chǎn)物

4、CCL21及約650bp大小的產(chǎn)物exCD40L，二者均與預(yù)期目的片段大小一致，通過(guò)重疊PCR方法順序連接CCL21與exCD40L、CCL21sig與exCD40L，分別得到產(chǎn)物大小約1100bp及720bp，與預(yù)期目的片段大小一致，將CCL21-linker-exCD40L、CCL21、CCL21sig-exCD40L進(jìn)一步連接入T載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，序列正確。以上構(gòu)建的3個(gè)重組T載體酶切后將目的片段與pcDNA3.1真核表達(dá)載體片段

5、連接，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1/CCL21－linker-exCD40L及對(duì)照組載體pcDNA3.1/CCL21、pcDNA3.1/CCL21sig-exCD40L，酶切驗(yàn)證，分別得到與目的基因及pcDNA3.1載體片段(約5400bp)。Westernblot法進(jìn)一步驗(yàn)證次結(jié)果，分子量分別約為43KD，14KD及30KD，與目的蛋白大小一致。通過(guò)Millicell小室法驗(yàn)證融合蛋白對(duì)樹(shù)突裝細(xì)胞具有較強(qiáng)趨化功能，其每高倍鏡視野穿

6、膜細(xì)胞數(shù)是空載體對(duì)照組的14.95倍。用小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系C26成功構(gòu)建小鼠腫瘤模型，腫瘤原位注射融合基因后，融合基因發(fā)揮抗腫瘤作用。 結(jié)論： 成功構(gòu)建分別攜帶CCL21-linker-exCD40L、CCL21、CCL21sig-exCD40L基因的真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后均能夠正常表達(dá)。 體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染融合基因的細(xì)胞載體對(duì)DCs具有趨化活性。瘤內(nèi)注射小鼠后，融合基因發(fā)揮的抗腫瘤作用，且抗腫瘤作用較CC