融合基因CCL21-CD40L對結(jié)腸癌主動免疫的誘導.pdf

1、目的： 樹突狀細胞是體內(nèi)功能最強的抗原提呈細胞，能夠捕獲、加工、提呈抗原，啟動免疫應(yīng)答，在免疫抗腫瘤方面發(fā)揮舉足輕重的作用。但是由于樹突狀細胞(Dendriticcells，DCs)制備過程長、生存期短，體外難以模擬其生理成熟等因素，制約了DC瘤苗的發(fā)展。本實驗擬構(gòu)建攜帶CCL21－linker-exCD40L融合基因的真核表達載體，通過融合基因在體內(nèi)腫瘤組織局部表達，趨化并活化DCs，發(fā)揮抗腫瘤作用。 方法：

2、首先，在GeneBank檢索小鼠CCL21及CD40L基因編碼序列，確定擴增區(qū)域，設(shè)計引物。以Trizol抽提小鼠脾臟總RNA，通過RT-PCR方法獲得CCL21及exCD40L基因。重疊PCR方法將CCL21分泌型信號肽(CCL21sig)與exCD40L連接，獲得CCL21sig-exCD40L基因，使得CD40L能夠以分泌形式表達，與CCL21基因分別作為融合基因的對照。重疊PCR構(gòu)建CCL21-linker-exCD40L融合基

3、因，將其克隆入T載體進行測序，將測序正確的融合基因片段連接到真核表達載體pcDNA3.1。將pcDNA3.1/CCL21-linker-exCD40L質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細胞，WesternBlot法檢測融合基因蛋白在細胞膜上的表達。通過趨化實驗對融合基因進行活性檢測。構(gòu)建小鼠結(jié)腸癌腫瘤模型，體外轉(zhuǎn)染CCL21-linker-exCD40L真核表達載體，驗證其抗腫瘤作用。 結(jié)果： 通過RT-PCR方法擴增約420bp大小的產(chǎn)物

4、CCL21及約650bp大小的產(chǎn)物exCD40L，二者均與預期目的片段大小一致，通過重疊PCR方法順序連接CCL21與exCD40L、CCL21sig與exCD40L，分別得到產(chǎn)物大小約1100bp及720bp，與預期目的片段大小一致，將CCL21-linker-exCD40L、CCL21、CCL21sig-exCD40L進一步連接入T載體，經(jīng)測序驗證，序列正確。以上構(gòu)建的3個重組T載體酶切后將目的片段與pcDNA3.1真核表達載體片段

5、連接，構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1/CCL21－linker-exCD40L及對照組載體pcDNA3.1/CCL21、pcDNA3.1/CCL21sig-exCD40L，酶切驗證，分別得到與目的基因及pcDNA3.1載體片段(約5400bp)。Westernblot法進一步驗證次結(jié)果，分子量分別約為43KD，14KD及30KD，與目的蛋白大小一致。通過Millicell小室法驗證融合蛋白對樹突裝細胞具有較強趨化功能，其每高倍鏡視野穿

6、膜細胞數(shù)是空載體對照組的14.95倍。用小鼠結(jié)腸癌細胞系C26成功構(gòu)建小鼠腫瘤模型，腫瘤原位注射融合基因后，融合基因發(fā)揮抗腫瘤作用。 結(jié)論： 成功構(gòu)建分別攜帶CCL21-linker-exCD40L、CCL21、CCL21sig-exCD40L基因的真核表達載體，將其轉(zhuǎn)染真核細胞后均能夠正常表達。 體外實驗證實轉(zhuǎn)染融合基因的細胞載體對DCs具有趨化活性。瘤內(nèi)注射小鼠后，融合基因發(fā)揮的抗腫瘤作用，且抗腫瘤作用較CC