利用無細(xì)胞體系和iTRAQ鑒定參與亮氨酸調(diào)節(jié)自噬通路的關(guān)鍵候選蛋白質(zhì).pdf

1、氨基酸不僅是機(jī)體合成蛋白質(zhì)的底物，亦是調(diào)節(jié)mTORC1信號通路和自噬通路的信號分子（特別是亮氨酸）。氨基酸饑餓會誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，而氨基酸供給充足則會抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生。近年來，一系列mTORC1上游信號分子得以鑒定并獲知其功能，有利于理解氨基酸激活mTORC1和調(diào)控自噬的分子機(jī)制。因細(xì)胞中還可能存在其它未知的蛋白質(zhì)參與氨基酸調(diào)節(jié)自噬信號通路。因此，如何有效篩選參與這一過程的未知蛋白質(zhì)是目前氨基酸調(diào)節(jié)自噬過程的研究熱點(diǎn)之一。
　

2、　本研究通過構(gòu)建用于研究自噬信號通路的Cell-free system，向該體系中添加單體氨基酸，來驗(yàn)證該種氨基酸是否對自噬具有調(diào)節(jié)作用，并結(jié)合比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法（同位素標(biāo)簽的相對和絕對定量技術(shù)，簡稱iTRAQ技術(shù)）初步鑒定參與該種氨基酸調(diào)節(jié)自噬信號通路的關(guān)鍵侯選蛋白。首先通過制備自噬體粗提物、S100（胞漿蛋白）、表達(dá)純化Atg14-Flag蛋白，構(gòu)建了用于研究自噬信號通路的Cell-free system，經(jīng)試驗(yàn)證明該體系具有較

3、好的有效性。Cell-free system構(gòu)建成功后，向該體系中添加了單體氨基酸，結(jié)果顯示在Cell-free system中亮氨酸和蛋氨酸對自噬信號通路可能具有調(diào)節(jié)作用。進(jìn)而初步選定亮氨酸為研究對象，運(yùn)用iTRAQ技術(shù)檢測添加了亮氨酸后Cell-free system的上清和沉淀，共鑒定到4811個(gè)蛋白，其中上清表達(dá)差異的蛋白(S2/S1)共243個(gè)，沉淀表達(dá)差異的蛋白(P2/P1)共134個(gè)（本研究中差異蛋白的判定標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)≥

4、1.2或≤0.83，且p-value＜0.05）。上清中表達(dá)差異的蛋白最顯著富集的代謝通路為氨酰-tRNA生物合成，提示該通路可能與亮氨酸調(diào)節(jié)自噬相關(guān)。沉淀中表達(dá)差異的蛋白顯著富集的代謝通路之一為氧化磷酸化，提示參與氧化磷酸化代謝通路的相關(guān)蛋白也可能與亮氨酸調(diào)節(jié)自噬相關(guān)。在上清中表達(dá)下調(diào)且沉淀中表達(dá)上調(diào)的蛋白共有12個(gè)(VPS35、CAND1、PKM、PYGL、XRCC6、IPO7、ILF2、GNPDA1、NCDN、NME1、SRP9、

5、SEPHS1)，在上清中表達(dá)上調(diào)且沉淀中表達(dá)下調(diào)的蛋白數(shù)目為零。經(jīng)過對上述12個(gè)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初步得到VPS35和CAND1很可能是參與亮氨酸調(diào)節(jié)自噬信號通路的關(guān)鍵蛋白。
　　綜上所述，(1)本研究成功的構(gòu)建了用于研究自噬信號通路的Cell-freesystem，且該體系具有較好的有效性。(2)初步篩選到亮氨酸和蛋氨酸在Cell-freesystem中對自噬信號通路可能存在一定的調(diào)節(jié)作用。(3)經(jīng)iTRAQ試驗(yàn)和生物信息