大腸桿菌無(wú)細(xì)胞體系高通量合成蛋白質(zhì)的探索性研究.pdf

1、與體內(nèi)合成蛋白質(zhì)相比，由于無(wú)細(xì)胞反應(yīng)體系的開(kāi)放性，無(wú)細(xì)胞體外合成蛋白質(zhì)的一個(gè)潛在的重要優(yōu)點(diǎn)是蛋白質(zhì)合成的高通量性。本文從無(wú)細(xì)胞反應(yīng)內(nèi)在效率的提高、基于目標(biāo)蛋白質(zhì)線性模板的無(wú)細(xì)胞反應(yīng)、DNA凝膠輔助的無(wú)細(xì)胞反應(yīng)、無(wú)細(xì)胞反應(yīng)器微型化及噴墨打印技術(shù)等多個(gè)角度研究了無(wú)細(xì)胞體系如何實(shí)現(xiàn)高通量蛋白質(zhì)的合成。
　　首先選擇了枯草芽孢桿菌木聚糖酶作為目標(biāo)蛋白，研究如何在大腸桿菌無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系實(shí)現(xiàn)功能性高效合成。通過(guò)對(duì)木聚糖酶基因N’端的信號(hào)肽

2、序列的突變，采用過(guò)量表達(dá)了分子伴侶的大腸桿菌制備無(wú)細(xì)胞抽提物，構(gòu)建了高效可溶性合成木聚糖酶的無(wú)細(xì)胞體系，并且通過(guò)在無(wú)細(xì)胞反應(yīng)體系中添加表面活性劑Triton X-100制備高活性的成熟木聚糖酶。結(jié)合優(yōu)化無(wú)細(xì)胞反應(yīng)條件，無(wú)細(xì)胞體系中表達(dá)的木聚糖酶的活性最終提高了6.1倍。這一組合表達(dá)策略成功應(yīng)用于其它四種具有代表性的重要的工業(yè)酶（包括堿性磷酸酶、葡萄糖脫氫酶、青霉素G?；D(zhuǎn)移酶以及脂肪酶）的體外無(wú)細(xì)胞表達(dá)，與常規(guī)的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)結(jié)果相比，

3、這四個(gè)酶的整體表達(dá)的水平均獲得了從3.2倍到5.3倍不等的增加。
　　在無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系中，以線性PCR產(chǎn)物為模板是實(shí)現(xiàn)高通量合成蛋白質(zhì)的一個(gè)基本策略。然而，由于無(wú)細(xì)胞體系中核酸酶的存在，線性模板極易降解，從而導(dǎo)致無(wú)細(xì)胞表達(dá)效率低。本文引入了DNA凝膠技術(shù)，將線性目標(biāo)基因模板交聯(lián)固定在凝膠內(nèi)部，從而提高以線性目標(biāo)基因片段為表達(dá)模板時(shí)無(wú)細(xì)胞反應(yīng)的效率。我們對(duì)DNA凝膠的制備方法進(jìn)行了改進(jìn)，開(kāi)發(fā)了基于乳液原理的高通量制備直徑為微米級(jí)

4、DNA凝膠微粒的新技術(shù)?；诖薉NA凝膠微粒的固相無(wú)細(xì)胞表達(dá)模式下，木聚糖酶表達(dá)效率與傳統(tǒng)的直接添加DNA模板的液相反應(yīng)體系相比提高了近十倍，有效提高了以線性DNA片段為表達(dá)模板時(shí)的無(wú)細(xì)胞表達(dá)效率。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了兩種更為穩(wěn)定而有效的方法，包括沖擊混合與膜過(guò)濾技術(shù)，最終可得到粒度平均分布僅為3μM的DNA凝膠微粒。
　　在DNA凝膠微顆粒與無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系的基礎(chǔ)上，結(jié)合脂質(zhì)體的制備方法，我們建立了一種高通量制備微米級(jí)微型

5、生物反應(yīng)器的方法。通過(guò)我們的方法所獲得的“人工細(xì)胞”（微型生物反應(yīng)器）具有磷脂雙分子層的外膜結(jié)構(gòu)以及固定了目標(biāo)基因模板的DNA凝膠內(nèi)核，中間部分則是用于蛋白合成的無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系。該“人工細(xì)胞”反應(yīng)器不僅有助于研究微體系下高效率的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)，尤其是膜蛋白的無(wú)細(xì)胞表達(dá)，而且整個(gè)系統(tǒng)從結(jié)構(gòu)到功能上都模擬了真正的細(xì)胞，因而具有極其重要的合成生物學(xué)意義。
　　最后，研究了商業(yè)化打印機(jī)作為一種高通量反應(yīng)技術(shù)在高通量分散生物樣品中的基本規(guī)律