金黃色葡萄球菌感染的奶牛乳腺組織iTRAQ蛋白質(zhì)組鑒定及候選基因表達調(diào)控分析.pdf

1、奶牛乳腺炎是造成經(jīng)濟損失最嚴(yán)重的疾病，且嚴(yán)重影響動物福利及產(chǎn)品質(zhì)量。它的發(fā)生主要是入侵病原體與機體免疫系統(tǒng)相互作用的結(jié)果，其中金黃色葡萄球球菌是主要的致病菌。蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)相結(jié)合，是研究免疫系統(tǒng)與病原菌的相互作用過程的有效方法。當(dāng)機體感染臨床乳腺炎時，蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用，可以獲得更加全面乖準(zhǔn)確的機體反應(yīng)特性，并識別生物標(biāo)記，更好的檢測和預(yù)防疾病的發(fā)生，減少牧場的經(jīng)濟損失。本文利用iTRAQ（相對和絕對定量同位素標(biāo)記）技術(shù)探索乳腺炎

2、對乳腺組織中蛋白質(zhì)組水平的影響。篩選健康乳腺組織和患病乳腺組織中差異表達蛋白，并利用生物信息學(xué)的方法對所篩選到的蛋白進行分析，尋找與奶牛炎癥、免疫或組織損傷相關(guān)的蛋白，并對一些候選基因進行了進一步的表達調(diào)控分析，實驗主要內(nèi)容如下:
　　一金黃色葡萄球菌感染的奶牛臨床乳腺炎乳腺組織蛋白組表達特征
　　本試驗利用相對和絕對定量同位素標(biāo)記技術(shù)(iTRAQ)篩選感染后期的乳腺組織中與乳腺炎相關(guān)的蛋白。利用iTRAQ和Orbi串聯(lián)質(zhì)譜

3、技術(shù)(Orbi-MS/MS)分析健康乳腺組織和乳腺炎乳腺組織，利用GO分析方法分析差異表達的蛋白，利用ProteinPilot軟件和DIA方法分析轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）和免疫組織化學(xué)染色法(IHC)對一組候選蛋白進行分析。錯誤發(fā)現(xiàn)率5％時，從6499個多肽中篩選出768個蛋白，它們與15879光譜圖相對應(yīng)。與健康乳腺組織相比，被金黃色葡萄球菌自然感染的乳房組織中，有36個蛋白表達量明顯升高（＞

4、1.5倍），19個明顯降低（＜0.67倍）。蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）結(jié)果表明，與健康組相比乳腺炎組中COL1A1和ITIH4蛋白的表達量均有顯著的增加(P＜0.05);免疫組織化學(xué)染色法(IHC)也檢測到乳腺炎組織中兩個蛋白的表達。本實驗探究了機體對乳腺炎病原體的遲發(fā)反應(yīng)，揭示了與宿主組織損傷相關(guān)的機制。生物信息學(xué)分析表明乳腺炎對一些蛋白表達的影響，如膠原蛋白、纖維蛋白原、纖連蛋白、酪蛋白以及類肝素硫酸蛋白聚糖2

5、?；既橄傺兹橄俳M織中，COL1A1、COL1A2和ITIH4的高表達可能與乳腺炎感染晚期的組織損傷和修復(fù)相關(guān)。
　　二奶牛COL1A2基因啟動子區(qū)甲基化與其基因表達及乳腺炎發(fā)生的相關(guān)性
　　本研究了分析奶牛健康乳腺組織和金黃色葡萄球菌感染的乳腺炎組織中膠原蛋白Ⅰ型α2鏈(COL1A2)基因啟動子區(qū)CpG島甲基化與COL1A2基因表達的調(diào)控關(guān)系。利用生物信息學(xué)方法，分析了COL1A2基因啟動子區(qū)CpG島分布及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點

6、，運用亞硫酸氫鹽測PCR(BSP)和RT-PCR法，分析健康乳腺組織和患乳腺炎乳腺組織中，COL1A2基因啟動子區(qū)的CpG島甲基化程度與COL1 A2基因表達及乳腺炎的相關(guān)性。結(jié)果表明，健康乳腺組織和患乳腺炎乳腺組織中CpG島甲基化差異不顯著(P＞0.05)，均呈低甲基化狀態(tài)(＜50％)，但位于轉(zhuǎn)錄因子SP1結(jié)合區(qū)域內(nèi)的第4和第5 CpG位點，健康組甲基化程度（30％和60％）顯著高于患病組（0％和10％）;健康組COL1A2基因mRN