大豆異黃酮對(duì)大鼠早期慢性移植腎病的干預(yù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景及意義 腎移植是慢性腎功能衰竭患者最有效的治療手段之一。近年來(lái)，隨著免疫抑制藥物的發(fā)展，腎移植急性排斥反應(yīng)明顯下降，移植腎的一年存活率大大提高，但移植腎的長(zhǎng)期存活率并未得到明顯改善，慢性移植腎病(ChronicAllograftNephropathy，CAN)是阻礙移植腎長(zhǎng)期存活最主要的原因。CAN主要表現(xiàn)為移植后數(shù)月或數(shù)年出現(xiàn)移植腎功能進(jìn)行性減退，伴有慢性間質(zhì)纖維化，小管萎縮，血管阻塞性病變以及腎小球硬化等病理改變。近

2、期研究證實(shí)：移植腎組織中的單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)以及血管平滑肌細(xì)胞增殖和向內(nèi)膜下移行是CAN發(fā)病早期兩個(gè)最重要的病理變化。同時(shí)有研究表明：在CAN大鼠模型中，移植后早期腎組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases-9，MMP-9)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)的表達(dá)水平明顯增高，并且與CAN早期病理改變呈正相關(guān)關(guān)系，提示MMP-9和TGF-β1在CAN

3、早期發(fā)病機(jī)制中有重要作用。 CAN一旦發(fā)生，將持續(xù)進(jìn)展。迄今為止，尚無(wú)任何藥物能真正有效地治療CAN，關(guān)鍵在于早期預(yù)防。盡管強(qiáng)有力的新型免疫抑制劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用在CAN的防治方面取得了一定的效果，但長(zhǎng)期用藥治療時(shí)毒副作用較多，而且費(fèi)用十分昂貴，因而迫切需要尋求更安全、有效、并且價(jià)廉的治療新方法。具有天然雌激素活性的大豆異黃酮(soybeanisoflavones)已經(jīng)被證實(shí)可以通過(guò)降血脂、抗氧化、抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及抑制細(xì)胞

4、增殖等多種途徑而發(fā)揮腎臟保護(hù)功能。由于這些免疫抑制與非免疫抑制效應(yīng)正好針對(duì)了CAN的發(fā)病機(jī)制，我們預(yù)測(cè)大豆異黃酮有可能對(duì)CAN的重要發(fā)病環(huán)節(jié)起作用，能夠保護(hù)移植腎功能，延緩CAN的發(fā)生和發(fā)展。重要的是異黃酮來(lái)源于普通的食物—大豆，廉價(jià)易得，長(zhǎng)期使用無(wú)任何毒副作用，有望開(kāi)創(chuàng)CAN防治的新思路。 本研究擬通過(guò)觀察大豆異黃酮對(duì)CAN早期腎功能、腎組織形態(tài)學(xué)方面的影響，來(lái)證實(shí)大豆異黃酮營(yíng)養(yǎng)干預(yù)治療對(duì)CAN的有效性；同時(shí)通過(guò)觀察CAN早期

5、移植腎間質(zhì)中MMP-9和TGF-β1表達(dá)水平的變化，初步探索大豆異黃酮延緩CAN進(jìn)展可能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用大豆異黃酮防治早期CAN提供科學(xué)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 1.制作F344-LewisCAN大鼠模型15只，按2：1的比例隨機(jī)分成兩組：CAN治療組10只，CAN對(duì)照組5只。另外，F(xiàn)344和Lewis大鼠各5只行單腎切除作為假手術(shù)對(duì)照組。治療組大鼠喂食含大豆異黃酮的飼料，對(duì)照組和假手術(shù)組喂食不含異黃酮的飼料。實(shí)驗(yàn)周期12

6、周。 2.CAN動(dòng)物模型制作：近交系同種Lewis大鼠接受Fisher大鼠，參照White氏方法，用顯微外科技術(shù)做左腎原位移植術(shù)。 3.分別于實(shí)驗(yàn)的第4、8和12周，測(cè)量體重；收集24小時(shí)尿進(jìn)行蛋白定量檢查；采集鼠尾靜脈血進(jìn)行血清肌酐和膽固醇測(cè)定，觀察大豆異黃酮對(duì)CAN早期移植腎功能和血脂的影響。 4.在實(shí)驗(yàn)的第12周末收獲動(dòng)物，取移植腎組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，觀察大豆異黃酮對(duì)CAN早期移植腎的組織形態(tài)學(xué)變化的影

7、響。 5.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，檢測(cè)CAN大鼠移植12周后移植腎間質(zhì)MMP-9和TGF-β1表達(dá)水平的變化，初步探索大豆異黃酮對(duì)早期CAN可能的作用機(jī)制。結(jié)果 1.成功制作了CAN大鼠模型。各組大鼠在性別、周齡方面無(wú)差別。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠體重增長(zhǎng)情況類似，相同時(shí)點(diǎn)的體重比較無(wú)差異。 2.實(shí)驗(yàn)12周時(shí)，CAN治療組和對(duì)照組的24小時(shí)蛋白尿分別為16.71±3.77mg/d和21.7±7.47mg/d，均明顯高于

8、與假手術(shù)組(P＜0.05)，但CAN治療組增加的程度低于CAN對(duì)照組，兩組之間有顯著性差異(P=0.017)。實(shí)驗(yàn)期間，CAN對(duì)照組的血清肌酐水平呈持續(xù)上升趨勢(shì)，而CAN治療組的血清肌酐水平和假手術(shù)對(duì)照組接近。第8周時(shí)，CAN治療組和對(duì)照組的血清肌酐分別為69.68±5.27μmol/L和81.24±12.64μmol/L，兩者之間有差異(P=0.031)，第12周時(shí)兩者之間的差異更加顯著(P=0.008)。 3.實(shí)驗(yàn)期間CAN

9、治療組的膽固醇水平穩(wěn)定，而CAN對(duì)照組的膽固醇水平出現(xiàn)持續(xù)增高的趨勢(shì)。第12周時(shí)，CAN對(duì)照組的膽固醇水平(2.26±0.38mmol/L)明顯高于CAN治療組(1.60±0.15mmol/L，P=0.001)和假手術(shù)組(P＜0.05)。 4.CAN大鼠模型移植12周的腎組織病理表現(xiàn)有：腎小球不同程度的系膜增生，球囊粘連和局灶節(jié)段性硬化；小管間質(zhì)明顯的單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)，局部小管萎縮，局灶性纖維化，小動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，中層平滑肌細(xì)胞增殖

10、并向內(nèi)膜移行。CAN治療組的病理表現(xiàn)僅為輕度的小管間質(zhì)單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)的小灶性間質(zhì)纖維化，腎小球及小血管病變不明顯。CAN治療組在慢性病變、腎組織單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)以及腎間質(zhì)纖維化評(píng)分上明顯優(yōu)于CAN對(duì)照組，均存在顯著性差異(P值分別為0.009；0.008和0.047)。 5.移植12周時(shí)CAN對(duì)照組的腎間質(zhì)MMP-9表達(dá)水平上調(diào)(5.37±0.79)，并且明顯高于CAN治療組(4.01±0.73；P=0.007)以及假手術(shù)組

11、F344大鼠(P=0.001)和Lewis大鼠(P=0.002)。CAN對(duì)照組的TGF-β1表達(dá)水平(2.54±0.67)上調(diào)，也高于CAN治療組(1.81±0.42；P=0.026)以及假手術(shù)組F344大鼠(P=0.024)和Lewis大鼠(P=0.035)。CAN大鼠模型12周移植腎組織間質(zhì)中MMP-9和TGF-β1表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系(R=0.603，P=0.022)。 結(jié)論 1.本研究成功建立了F344-Lewi

12、s大鼠CAN模型。該模型在12周時(shí)，腎組織病理的顯著特征為：腎小管間質(zhì)的單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)，血管平滑肌細(xì)胞的增殖和移行，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，提示該時(shí)段為CAN的早期階段。 2.CAN大鼠移植12周時(shí)，24小時(shí)蛋白尿和血清肌酐水平明顯增高，大豆異黃酮治療明顯減緩了CAN大鼠血清肌酐的增長(zhǎng)，在改善蛋白尿方面也有一定的作用。實(shí)驗(yàn)期間，大豆異黃酮治療組顯著有效地控制了膽固醇水平的增長(zhǎng)。大豆異黃酮對(duì)膽固醇良好的調(diào)節(jié)作用可能參與了對(duì)CAN大鼠移植

13、腎的保護(hù)機(jī)制。 3.大豆異黃酮治療12周，有效地改善了CAN大鼠腎組織的單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)、血管平滑肌細(xì)胞的增殖和移行、慢性病變Banff評(píng)分以及腎問(wèn)質(zhì)的纖維化程度。與此同時(shí)，大豆異黃酮可以干預(yù)下調(diào)CAN早期腎問(wèn)質(zhì)MMP-9和TGF-β1的表達(dá)水平，可能是大豆異黃酮延緩CAN移植腎組織早期病變的機(jī)制之一。 4.由于大豆異黃酮來(lái)源于天然食物，無(wú)任何毒副作用，用飲食營(yíng)養(yǎng)干預(yù)的模式對(duì)需要長(zhǎng)期用藥的CAN進(jìn)行治療，不失為一種安全有效