中風(fēng)康抑制局灶性腦缺血大鼠炎性損傷的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：在建立局灶性腦缺血大鼠模型基礎(chǔ)上，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證中風(fēng)康抗局灶性腦缺血，縮小腦梗死體積的療效，并從抑制炎性損傷的角度探討其作用機(jī)制。 方法 第一部分：中風(fēng)康對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦梗死體積和病理組織學(xué)的影響 1.中風(fēng)康對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦梗死體積的影響 健康SD大鼠，體重250～300g，大鼠隨機(jī)分為4組，即模型組、中風(fēng)康高劑量組(簡稱高劑量組)、中風(fēng)康低劑量組(簡稱低劑量組)、步長腦心通對(duì)照組(簡稱

2、腦心通組)，每組每時(shí)間點(diǎn)取8只大鼠。高、低劑量組和腦心通組從術(shù)前5天至處死前每天灌胃給藥，劑量分別為：中風(fēng)康高劑量組18.8g/kg，中風(fēng)康低劑量組9.4g/kg，步長腦心通組0.33g/kg。模型組予0.5％的羧甲基纖維素鈉液灌胃，一日一次。 參照文獻(xiàn)，采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血模型，大鼠腹腔內(nèi)注射10％水合氯醛(350mg/Kg體重)麻醉后，仰臥固定，頸部正中切口，分離并暴露右側(cè)頸總及頸內(nèi)、外動(dòng)脈，并在頸內(nèi)外動(dòng)脈分

3、叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，右側(cè)頸總動(dòng)脈剪口，插入頭端燒成圓鈍形直徑為0.25mm的尼龍魚線，進(jìn)線長度約18～19mm，在大腦中動(dòng)脈起始端堵塞大腦中動(dòng)脈，然后將頸總動(dòng)脈連同尼龍魚線一起結(jié)扎，縫合皮膚，放回籠內(nèi)，單籠喂養(yǎng)。假手術(shù)組只分離、暴露血管，不結(jié)扎頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，不插入尼龍魚線。選擇蘇醒后左上肢屈曲、行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)或左側(cè)肢體癱瘓的大鼠為栓堵成功者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，否則視為栓堵失敗，棄之不用。手術(shù)過程中監(jiān)測(cè)大鼠直腸溫度，并用電熱毯保持在36.5～

4、37.5℃。 于造模成功后6h、12h、24h、48h檢測(cè)各組大鼠腦梗死體積的變化。動(dòng)物麻醉，斷頭取腦。腦組織冷凍后間隔1mm連續(xù)冠狀位切片，加入2％的TTC染色，37℃恒溫孵育30min，正常腦組織染為深紅色，腦梗死區(qū)不染色，呈灰白色，再置于2％多聚甲醛磷酸緩沖液固定24h。剝離腦片的梗死區(qū)部分，按文獻(xiàn)用排水法測(cè)腦梗死體積。 2.中風(fēng)康對(duì)局灶性腦缺血腦病理組織學(xué)的影響 健康SD大鼠，體重250～300g，大鼠隨

5、機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、模型組、中風(fēng)康高劑量組(簡稱高劑量組)、中風(fēng)康低劑量組(簡稱低劑量組)、步長腦心通對(duì)照組(簡稱腦心通組)，每組取5只大鼠。給藥劑量同上，假手術(shù)組、予0.5％的羧甲基纖維素鈉液灌胃，一日一次。 造模方法同上，造模成功后48h，處死各組大鼠，取右側(cè)大腦額頂葉腦皮質(zhì)組織，10％的甲醛固定，乙醇逐級(jí)脫水，石蠟包埋，切片機(jī)切片，HE染色，光鏡觀察并攝像。 數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，用SPSSf

6、orWindows10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組比較先采用單因素方差分析，然后用Student-Newman-KeulsTest進(jìn)行每兩組間比較；兩組比較采用t檢驗(yàn)。 第二部分：中風(fēng)康對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織TNF-α、IL-8含量的影響 動(dòng)物分組、造模方法、用藥情況同前，造模成功后分別于6h、12h、24h、48h麻醉各組大鼠，斷頭取右側(cè)大腦，去除小腦和延髓部分，稱重后移入玻璃勻漿管中，加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，冰盤上充

7、分研碎，使組織勻漿化。制備好的10％勻漿3500r/min離心10min，提取上清待測(cè)，檢測(cè)各組大鼠TNF-α、IL-8含量的變化。 用放射免疫法檢測(cè)TNF-α、IL-8含量，并用腦組織蛋白含量校正。 第三部分：中風(fēng)康對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織ICAM-1、MMP-9的影響 動(dòng)物分組、造模方法、用藥情況同前，造模成功后分別于6h、12h、24h、48h麻醉各組大鼠，斷頭取右側(cè)大腦，去除小腦和延髓部分，稱重后移入玻璃

8、勻漿管中，加入等倍體積的預(yù)冷生理鹽水，冰盤上充分研碎，使組織勻漿化。制備好的50％勻漿3500r/min離心10min，提取上清待測(cè)。 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定ICAM-1、MMP-9含量。用蛋白含量校正ICAM-1濃度；在492nm測(cè)MMP-9的OD值，MMP-9濃度與OD值成正比，用酶標(biāo)儀測(cè)得OD值間接反映其量的變化。 結(jié)果 第一部分：中風(fēng)康對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦梗死體積和病理組織學(xué)的影響

9、 1.中風(fēng)康對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦梗死體積的影響 局灶性腦缺血6h，梗死灶迅速擴(kuò)大(P＜0.01)，隨缺血時(shí)間延長，局灶性腦缺血大鼠梗死灶體積緩慢進(jìn)展，至48小時(shí)，梗死灶略有縮小(P＜0.01)；與模型組比較，各治療組梗死灶體積均有不同程度縮小，以高劑量組降低最為顯著(P＜0.05或P＜0.01)。 2.中風(fēng)康對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦病理組織學(xué)的影響 假手術(shù)組：神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及毛細(xì)血管形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，核仁清晰，

10、胞漿無紅染。 模型組：局灶性腦缺血48小時(shí)，腦皮質(zhì)呈篩狀壞死灶，可見大量死亡神經(jīng)元，壞死灶中以膠質(zhì)細(xì)胞為主，間質(zhì)水腫明顯，缺血周圍區(qū)錐體細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞體積縮小，核不規(guī)則；星形細(xì)胞腫脹、數(shù)量較正常組增多；血管周圍間隙較正常組明顯擴(kuò)大，血管結(jié)構(gòu)無明顯變化，但可見血管周圍炎性細(xì)胞浸潤。 治療組：與模型組比較，各治療組壞死的神經(jīng)細(xì)胞較少，錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂程度明顯較輕，水腫較輕，炎細(xì)胞浸潤較少，尤以高劑量組減輕最明顯。

11、 第二部分：中風(fēng)康對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織TNF-α、IL-8含量的影響 1.中風(fēng)康對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織TNF-α含量的影響 與假手術(shù)組比較，局灶性腦缺血6h，模型組腦組織TNF-α含量開始升高，12h達(dá)到高峰(P＜0.01)，與同時(shí)點(diǎn)模型組比較，各治療組腦組織TNF-α含量均有不同程度的下降，尤其在缺血24h內(nèi)下降最為顯著(P＜0.05或P＜0.01)。 2.中風(fēng)康對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織IL-8的影響

12、 與假手術(shù)組比較，局灶性腦缺血6h，模型組腦組織IL-8含量降低(P＜0.01)，12h開始增加，至24小時(shí)達(dá)到高峰(P＜0.01)，與同時(shí)點(diǎn)模型組比較，局灶性腦缺血6h，各治療組腦組織IL-8含量增加(P＜0.05)，缺血24-48h，中風(fēng)康高、低劑量組均能降低腦組織IL-8含量(P＜0.05)。 第三部分：中風(fēng)康對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織ICAM-1、MMP-9的影響 1.中風(fēng)康對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織ICAM-1

13、的影響 與假手術(shù)組比較，局灶性腦缺血6h，模型組腦組織ICAM-1含量開始增加(P＜0.05)，至24h達(dá)到高峰(P＜0.01)；與同時(shí)點(diǎn)模型組比較，各治療組腦組織ICAM-1含量有不同程度降低，以高劑量組降低最為顯著(P＜0.01)，且缺血12h和24h高劑量組明顯低于腦心通組(P＜0.05)。 2.中風(fēng)康對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織MMP-9的影響與假手術(shù)組比較，局灶性腦缺血6h，模型組腦組織MMP-9開始增加，至24h

14、達(dá)到高峰(P＜0.01)；與同時(shí)點(diǎn)模型組比較，各治療組腦組織MMP-9均有不同程度降低(P＜0.05或P＜0.01)。 結(jié)論 1.中風(fēng)康可改善缺血時(shí)腦組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，明顯縮小局灶性腦缺血大鼠腦梗死體積，保護(hù)缺血腦組織。 2.中風(fēng)康可降低局灶性腦缺血模型大鼠腦組織的TNF-α含量，調(diào)節(jié)IL-8含量，通過調(diào)節(jié)前炎性介質(zhì)釋放，減輕腦缺血的炎性損傷。 3.中風(fēng)康可降低局灶性腦缺血模型大鼠腦組織的ICAM-1、