肉桂醛對(duì)局灶性腦缺血小鼠的腦保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、本研究選用雄性CD-1小鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用改良Longa線栓法建立小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型(permanent middle cerebralartery occlusion，pMCAO)模型。在小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞所致的局灶性腦缺血模型中應(yīng)用肉桂醛進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)對(duì)腦梗死體積、腦組織含水量及神經(jīng)功能缺損評(píng)估，觀察肉桂醛對(duì)局灶性腦缺血小鼠的腦保護(hù)作用;通過(guò)對(duì)腦組織炎癥介質(zhì)釋放，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度測(cè)定，觀察局灶性腦缺血后肉桂醛的抗炎

2、癥損傷作用;通過(guò)對(duì)TLR4/TRAF6/NF-κB通路相關(guān)因子表達(dá)的測(cè)定，觀察肉桂醛對(duì)TLR4/TRAF6/NF-κB促炎信號(hào)通路的影響，探討局灶性腦缺血后肉桂醛抗炎及腦保護(hù)作用可能的機(jī)制。本研究分為三部分，現(xiàn)將各部分內(nèi)容概述如下。
　　第一部分 肉桂醛對(duì)局灶性腦缺血小鼠的腦保護(hù)作用
　　目的:觀察小鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦組織含水量、腦梗死體積。研究肉桂醛對(duì)局灶性腦缺血小鼠的腦保護(hù)作用。
　　方法:選用成

3、年雄性CD-1小鼠、采用改良線栓法制備大腦中動(dòng)脈閉塞模型。在大腦中動(dòng)脈閉塞的24 h和72 h后，通過(guò)Bederson法評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺損，干濕重法測(cè)定腦組織含水量，2％2，3，5-三苯基四唑氮紅(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法測(cè)定腦梗死體積，觀察肉桂醛的神經(jīng)保護(hù)作用。隨機(jī)將CD-1小鼠分為7組:假手術(shù)組(Sham+生理鹽水，Sham+0.2％ DMSO):小鼠假手術(shù)后腹腔注射等量生理鹽水或者0

4、.2％ DMSO;大腦中動(dòng)脈閉塞組(MCAO+生理鹽水，MCAO+0.2％ DMSO):小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后即刻腹腔注射等量生理鹽水或者0.2％ DMSO;肉桂醛低劑量組（CA25組）:小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后即刻腹腔注射肉桂醛25 mg/kg;肉桂醛中劑量組（CA50組）:小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后即刻腹腔注射肉桂醛50 mg/kg;肉桂醛高劑量組（CA75組）:小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后即刻腹腔注射肉桂醛75mg/kg。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們?cè)诩偈中g(shù)組和

5、大腦中動(dòng)脈閉塞組中發(fā)現(xiàn)小鼠給予等量生理鹽水或者0.2％ DMSO，兩者神經(jīng)功能缺損評(píng)分，腦組織含水量，腦梗死體積測(cè)定是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的，因此，我們除外了溶劑，即0.2％ DMSO的生物學(xué)效應(yīng)。最終共有5組:Sham組（小鼠假手術(shù)后腹腔注射0.2％ DMSO），MCAO組(小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后腹腔注射0.2％ DMSO)，CA25組，CA50組和CA75組被納入接下來(lái)的試驗(yàn)。為了更進(jìn)一步評(píng)價(jià)肉桂醛的腦保護(hù)作用，我們觀察了肉桂醛不同時(shí)間點(diǎn)給

6、藥對(duì)局灶性腦缺血小鼠的腦保護(hù)作用。分別在缺血前1h，缺血后即刻、4h及8h，腹腔注射肉桂醛50 mg/kg，在缺血后24 h觀察小鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分，腦梗死體積，從而評(píng)價(jià)肉桂醛于不同時(shí)間點(diǎn)給藥對(duì)腦缺血小鼠的腦保護(hù)作用。
　　結(jié)果:
　　1.Sham組無(wú)神經(jīng)功能缺損，神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分;MCAO組在24 h和72 h神經(jīng)功能缺損評(píng)分均較嚴(yán)重;CA25組在24 h和72 h與MCAO組相比神經(jīng)功能缺損評(píng)分沒(méi)有明顯降低，差異

7、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CA50組和CA75組在24 h和72 h與MCAO組相比神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.CA25組的腦組織含水量在24 h和72 h與MCAO組相比均沒(méi)有明顯降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，CA50組和CA75組的腦組織含水量在24 h和72 h與MCAO組相比均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.CA25組的腦梗死體積在24

8、 h和72 h與MCAO組相比均沒(méi)有顯著降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，CA50和CA75組的腦梗死體積在24 h和72 h分別與MCAO組相比均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。據(jù)此，我們從神經(jīng)功能缺損評(píng)分，腦水腫，腦梗死體積三方面觀察，發(fā)現(xiàn)肉桂醛以高劑量(75 mg/kg)和中劑量(50mg/kg)給藥時(shí)可以發(fā)揮較好的治療效果，因此，后續(xù)的研究主要集中在肉桂醛的中劑量（50 mg/kg）。
　　4.于缺血前

9、1小時(shí)，缺血后后即刻和4小時(shí)腹腔給予肉桂醛(50mg/kg)，神經(jīng)功能缺損評(píng)分和梗死體積較MCAO組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而在缺血后8小時(shí)給予肉桂醛，神經(jīng)功能缺損評(píng)分和梗死體積和MCAO組相比無(wú)明顯降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:缺血后即刻腹腔注射肉桂醛對(duì)局灶性腦缺血小鼠具有腦保護(hù)作用，能夠改善腦缺血損傷后的神經(jīng)功能缺損，減輕腦組織含水量并減小腦梗死體積。不僅如此，肉桂醛于缺血前1小時(shí)，

10、缺血后4小時(shí)給藥仍然具有腦保護(hù)作用。
　　第二部分 肉桂醛對(duì)局灶性腦缺血小鼠的抗炎作用
　　目的:通過(guò)對(duì)腦組織炎癥介質(zhì)釋放，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度測(cè)定，觀察局灶性腦缺血后肉桂醛的抗炎癥損傷作用。
　　方法:選用成年雄性CD-1小鼠為研究對(duì)象，采用改良Longa線栓法制備大腦中動(dòng)脈閉塞模型。隨機(jī)將CD-1小鼠分為3組:假手術(shù)組（Sham組），假手術(shù)后腹腔注射0.2％ DMSO;大腦中動(dòng)脈閉塞組(MCAO組)，小鼠大腦中動(dòng)脈閉

11、塞后腹腔注射等量0.2％ DMSO;肉桂醛中劑量組（CA50組），小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后腹腔注射肉桂醛50 mg/kg;各組取材前進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，分別于缺血后24 h和72 h，應(yīng)用免疫組化，Western-blot，MPO活性試劑盒及qRT-PCR方法檢測(cè)缺血腦組織中MPO表達(dá)、MPO活性和炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　結(jié)果:缺血后24 h和72 h，MPO的表達(dá)及活性均有升高，肉桂醛(50mg/kg)干預(yù)后MPO表達(dá)水平及

12、活性下降。
　　1.通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，與MCAO組相比，CA50組的MPO陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在24 h和72 h均有顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.通過(guò)Western-blot發(fā)現(xiàn)，與MCAO組相比，CA50組MPO蛋白表達(dá)水平在24 h和72 h與MCAO組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.與免疫組化染色和Western-blot的結(jié)果一致，CA50組的MPO活性在24

13、h和72 h和MCAO組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.通過(guò)qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，炎癥介質(zhì)(TNF-α，IL-1β，MCP-1，ELAM-1)在局灶性腦缺后24 h顯著升高，肉桂醛(50 mg/kg)于局灶性腦缺血后24 h能夠顯著降低上述炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄水平，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在局灶性缺血72 h后，和MCAO組相比，CA50組TNF-α和MCP-1 mRNA水平明顯減低(P＜0.05)，

14、然而，IL-1β和ELAM-1 mRNA水平?jīng)]有明顯變化(P＞0.05)。
　　結(jié)論:局灶性腦缺血后24 h和72 h，缺血腦組織的炎癥介質(zhì)（炎性因子，趨化因子及粘附因子）的轉(zhuǎn)錄水平及MPO表達(dá)、活性均顯著升高，而肉桂醛能夠明顯減低缺血腦組織炎癥介質(zhì)的釋放、MPO表達(dá)及MPO活性，提示肉桂醛能夠抑制缺血腦組織炎癥介質(zhì)的釋放及中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。而肉桂醛抑制炎癥介質(zhì)釋放及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和對(duì)局灶性腦缺血小鼠的腦保護(hù)作用是一致的，故我們推

15、測(cè)肉桂醛可能通過(guò)抗炎癥損傷發(fā)揮其腦保護(hù)作用。
　　第三部分 肉桂醛對(duì)局灶性腦缺血后TLR4/TRAF6/NF-κB通路影響
　　目的:觀察腦缺血損傷后不同時(shí)間點(diǎn)TLR4/TRAF6/NF-κB通路相關(guān)因子的表達(dá)變化，研究肉桂醛對(duì)局灶性腦缺血小鼠抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用的可能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法:選用成年雄性CD-1小鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用改良Longa線栓法制備小鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞模型(MCAO)。隨機(jī)將CD-1小鼠分為3

16、組:假手術(shù)組（Sham組），假手術(shù)后腹腔注射0.2％ DMSO;大腦中動(dòng)脈阻塞組（MCAO組），小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞后腹腔注射等量0.2％ DMSO;肉桂醛中劑量組（CA50組），小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞后腹腔注射肉桂醛50 mg/kg;各組取材前進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，分別用免疫組化，Western-blot和qRT-PCR的方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)缺血腦組織中TLR4，TRAF6及NF-κB蛋白表達(dá)和mRNA水平的變化。
　　結(jié)果:缺血后24 h

17、和72 h，TLR4、TRAF6及NF-κB的表達(dá)均有升高，而肉桂醛(50 mg/kg)降低局灶性腦缺血小鼠腦組織中TLR4、TRAF6及NF-κB表達(dá)。
　　1.通過(guò)免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)，與MCAO組相比，CA50組TLR4、TRAF6及NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在24 h和72 h均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.通過(guò)Western-blot分析發(fā)現(xiàn)，CA50組TLR4、TRAF6及NF-κB蛋白表達(dá)水平

18、在24 h和72 h與MCAO組相比顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.與免疫組化染色分析和Western-blot的結(jié)果一致，CA50組mRNA水平在24 h和72 h與MCAO組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:局灶性腦缺血后，肉桂醛對(duì)缺血腦組織中的TLR4、TRAF6、NF-κB表達(dá)的抑制與肉桂醛腦保護(hù)作用及抗炎癥損傷程度一致，提示肉桂醛有可能通過(guò)抑制TLR4/TRAF6/N