抗IL-13全人源單鏈抗體的篩選、可溶性表達(dá)及鑒定.pdf

1、目的：上世紀(jì)80年代，隨著DNA重組技術(shù)的成熟，將其廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和抗體基因結(jié)構(gòu)的改造?？贵w制備技術(shù)已從多克隆抗體、單克隆抗體發(fā)展到基因工程抗體。隨著噬菌體展示技術(shù)、酵母展示技術(shù)等的出現(xiàn)大大提高了抗體的制備?；蚬こ炭贵w又經(jīng)歷了Fab抗體、scFv抗體、全人源抗體等，其具有穿透性強(qiáng)，分子量小，便于操作，不與Fc受體結(jié)合等特點(diǎn)，成為基因工程抗體研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，隨著深入的研究，體外篩選技術(shù)成為篩選全人源抗體的主要方式。支氣管哮喘是一

2、種與遺傳和環(huán)境密切相關(guān)的疾病，在過(guò)去幾十年里，支氣管哮喘發(fā)作在發(fā)達(dá)國(guó)家中逐年上升的趨勢(shì)。相比之下，遺傳因素一定在這樣一個(gè)相對(duì)較短的時(shí)間不變。雖然數(shù)百研究員列出了幾個(gè)潛在的遺傳因素可能影響疾病易感性，但沒(méi)有成功的嘗試針對(duì)任何特定的基因因素來(lái)治療支氣管哮喘。根據(jù)哮喘的發(fā)病機(jī)制從基礎(chǔ)分子免疫學(xué)、分子病理生理學(xué)的新發(fā)現(xiàn)去針對(duì)性的研制依從性較好、副作用少，可以改善患者病癥的藥物。無(wú)論是在小鼠和人上，細(xì)胞因子在哮喘的病理生理學(xué)非常重要，提出了一種抑

3、制Th2等細(xì)胞因子如白介素(IL)-4，IL-5，和IL-13可能是一個(gè)合理的治療哮喘方法。其中IL-13主要由CD4+Th2細(xì)胞和2型固有淋巴細(xì)胞(ILC2)分泌， IL-13誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞合成大量的IgE抗體，同時(shí)增加嗜酸性粒細(xì)胞的募集，引起氣道上皮細(xì)胞表達(dá)iNOS，黏液產(chǎn)生和杯狀細(xì)胞增生，刺激氣道平滑肌收縮，提高細(xì)胞外膠原蛋白和纖維母細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變等，IL-13通過(guò)IL-13Rα1與IL-4R形成受體復(fù)合物，參與信號(hào)轉(zhuǎn)

4、導(dǎo)，激活靶基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)TH0細(xì)胞分化、氣道炎癥、氣道高反應(yīng)、黏液產(chǎn)生。因此，IL-13在哮喘氣道炎癥和重塑有顯著的影響。本實(shí)驗(yàn)將從前期構(gòu)建的天然全人源抗體文庫(kù)中篩選特異性好、有體外中和活性的抗IL-13單鏈抗體，為后期構(gòu)建抗IL-4/IL-13雙特異性抗體及研制治療過(guò)敏性哮喘的抗體藥物奠定基礎(chǔ)。
　　方法：構(gòu)建I L-13 cDNA/pET101/D-TOPO表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)菌體中，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，并進(jìn)行純

5、化和鑒定。以生物素化IL-13蛋白為抗原，對(duì)前期構(gòu)建的天然抗體文庫(kù)利用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行3輪富集，在富集的單鏈抗體文庫(kù)中用ELISA篩選抗IL-13全人源單鏈抗體(scFv)。用BstNⅠ酶切方法對(duì)篩選抗IL-13-scFv陽(yáng)性克隆子進(jìn)行指紋圖分析，將指紋圖譜不同的克隆子送去測(cè)序。結(jié)果顯示在單鏈抗體氨基酸序列中出現(xiàn)了琥珀終止密碼子，位于第32位氨基酸處。將琥珀密碼子進(jìn)行校正，利用單點(diǎn)突變的方法突變終止密碼子中的一對(duì)堿基后變?yōu)榘被酺rp

6、(W)。將校正后的基因雙酶切后連接LZ16載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5aF，后進(jìn)行表達(dá)純化，用Dot Blot及Western Blot方法對(duì)表達(dá)純化的抗IL-13-scFv蛋白進(jìn)行鑒定;用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)scFv和IL-13受體（IL-13Rα1）的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，分析scFv和IL-13受體（IL-13Rα1）是否作用于IL-13的同一抗原表位。從而達(dá)到封阻IL-13與受體結(jié)合的功能。用大分子相互作用分析技術(shù)對(duì)抗IL-13全人源單鏈抗體

7、進(jìn)行親和力分析。
　　結(jié)果：⑴IL-13抗原的表達(dá)純化及鑒定:將擴(kuò)增大小為700bp左右的cDNA與pET101/D-TOPO連接，轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21進(jìn)行包涵體表達(dá)，表達(dá)的蛋白分子量大小為29KDa左右，經(jīng)Dot Blot及Western Blot鑒定表明有顯色且條帶唯一，則為IL-13抗原蛋白。⑵抗IL-13全人源單鏈抗體篩選與表達(dá):以生物素化IL-13蛋白為抗原，對(duì)前期構(gòu)建的天然抗體文庫(kù)利用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行3輪富集，通過(guò)

8、ELISA檢測(cè)有30％的scFv與IL-13有結(jié)合性;將得到的陽(yáng)性克隆子與IL-4，TSLP通過(guò)ELISA檢測(cè)特異性，結(jié)果顯示有一些單克隆子與IL-4，TSLP不結(jié)合，即不顯色，說(shuō)明此單克隆子有較好的特異性，與其他細(xì)胞因子交叉反應(yīng)較低。挑選14個(gè)OD值較高的抗IL-13-scFv陽(yáng)性克隆子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用BstNⅠ酶切方法對(duì)其進(jìn)行指紋圖分析，將指紋圖譜不同的克隆子送去測(cè)序。結(jié)果顯示在單鏈抗體氨基酸序列中出現(xiàn)了琥珀終止密碼子，位于第32

9、位氨基酸處。對(duì)琥珀密碼子進(jìn)行校正，利用單點(diǎn)突變的方法突變終止密碼子中的一對(duì)堿基后變?yōu)榘被酺rp(W)。將校正后的基因雙酶切后與原核分泌性表達(dá)載體L716連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體IL-13-scFv/LZ16，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5αF'進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確后進(jìn)行蛋白表達(dá)和純化。對(duì)單鏈抗體進(jìn)行表達(dá)及純化，結(jié)果顯示scFv在大腸桿菌DH5αF'中主要集中分泌在細(xì)胞周質(zhì)間可溶性表達(dá)，抗體具備生物學(xué)活性，SDS-PAGE電泳顯示純化后的抗IL-13

10、-scFv蛋白分子量大小為26KDa左右。⑶抗IL-13全人源單鏈抗體特性分析:Western Blot結(jié)果表明有顯色，且條帶唯一，即純化得到的蛋白為抗IL-13-scFv。競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果顯示:IL-13Rα1和篩選的單鏈抗體可競(jìng)爭(zhēng)性的與IL-13結(jié)合，說(shuō)明IL-13Rα1與單鏈抗體作用于IL-13的相同抗原表位，可有效的封阻IL-13/IL-13Rα1的信號(hào)通路具有生物學(xué)功能。大分子相互作用實(shí)驗(yàn)(Blitz)結(jié)果顯示抗IL-13全