14-3-3γ對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成和細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié).pdf

1、奶牛的乳品質(zhì)是衡量經(jīng)濟(jì)效益的重要標(biāo)準(zhǔn)。乳蛋白的含量是牛奶品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。我國奶牛普遍存在乳蛋白含量偏低的重大問題，因此亟需闡明乳蛋白合成的機(jī)理，從而找到改善乳品質(zhì)的有效技術(shù)途徑。乳蛋白合成機(jī)理是分子生物學(xué)和泌乳生理學(xué)領(lǐng)域重要的課題之一。目前研究已經(jīng)取得了很多重大的進(jìn)展，證實(shí)了JAK/Stat5和mTOR/S6K1信號(hào)途徑對(duì)于乳蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯是至關(guān)重要的。另外，乳蛋白合成還直接受到乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖情況的影響。14-3-3蛋白廣泛

2、分布于各種生物體組織和細(xì)胞中，參與很多生物學(xué)過程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。14-3-3蛋白決定其底物的亞細(xì)胞定位，以促進(jìn)或抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括mTOR也能夠被14-3-3調(diào)節(jié)。14-3-3蛋白具有不同的功能，并與很多底物發(fā)生相互作用。盡管進(jìn)行了廣泛的研究，但14-3-3對(duì)蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞增殖發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的具體機(jī)制仍需進(jìn)行深入探索。本實(shí)驗(yàn)室前期通過蛋白質(zhì)雙向電泳和質(zhì)譜鑒定分析發(fā)現(xiàn)14-3-3

3、γ與乳蛋白合成相關(guān)，提示14-3-3γ可能參與乳蛋白合成的調(diào)控過程。本研究針對(duì)14-3-3γ的泌乳調(diào)節(jié)功能、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)功能、相互作用蛋白鑒定等進(jìn)行分析，旨在揭示14-3-3γ通過互作蛋白調(diào)控乳蛋白合成和細(xì)胞增殖的分子機(jī)理。
　　實(shí)驗(yàn)首先采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞中cytokeratin18和β-酪蛋白的表達(dá)，以鑒定奶牛乳腺上皮細(xì)胞的純度和泌乳功能。添加濃度為0.6mM的蛋氨酸處理細(xì)胞24h，通過westernblotting技術(shù)

4、檢測(cè)蛋氨酸對(duì)14-3-3γ和β-酪蛋白表達(dá)的影響。利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)蛋氨酸對(duì)14-3-3γ表達(dá)的影響。采用Casy(@) Model DT細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)蛋氨酸刺激對(duì)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力的影響。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)添加蛋氨酸后細(xì)胞的增殖率和周期的變化。進(jìn)一步構(gòu)建14-3-3γ的真核表達(dá)載體進(jìn)行14-3-3γ過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，合成14-3-3γ的抑制片段進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)。通過western blotting技術(shù)檢測(cè)了14-3-3γ過表達(dá)和抑制后mTOR、

5、p-mTOR、Stat5a、p-Stat5a、CyclinD1和β-酪蛋白蛋白質(zhì)水平的變化。利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了14-3-3γ過表達(dá)和抑制后對(duì)p-mTOR和p-Stat5a水平的影響。采用Casy(@) Model DT細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)14-3-3γ過表達(dá)和抑制對(duì)細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖率和細(xì)胞周期的影響。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過免疫共沉淀和質(zhì)譜鑒定技術(shù)尋找與14-3-3γ相互作用并且與乳蛋白合成有關(guān)的蛋白質(zhì)，并探究14-3-3γ過

6、表達(dá)和抑制對(duì)互作蛋白表達(dá)的影響，以及過表達(dá)互作蛋白后乳蛋白合成的變化。
　　本研究確定了蛋氨酸對(duì)14-3-3γ表達(dá)和細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示加蛋氨酸組的細(xì)胞中14-3-3γ和β-酪蛋白表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組。加蛋氨酸使乳腺上皮細(xì)胞數(shù)明顯增加，且細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)。此外，加蛋氨酸組的乳腺上皮細(xì)胞增殖率顯著高于空白對(duì)照組，加蛋氨酸組的處于S期和G2-M期的乳腺上皮細(xì)胞百分比均明顯升高，而G0-G1期細(xì)胞百分比明顯下降。這表明乳蛋白合成

7、和細(xì)胞增殖與14-3-3γ有關(guān)。
　　本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了14-3-3γ過表達(dá)和抑制對(duì)乳蛋白合成和細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示14-3-3γ過表達(dá)可以上調(diào)mTOR、Stat5a和β-酪蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，并促進(jìn)mTOR和Stat5a兩個(gè)蛋白發(fā)生磷酸化，而抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果與過表達(dá)相反。過表達(dá)14-3-3γ使細(xì)胞數(shù)明顯增加，且細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)。此外，過表達(dá)14-3-3γ的乳腺上皮細(xì)胞增殖率顯著高于空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載體組，且處于S期和G2-M

8、期的細(xì)胞百分比均明顯升高，而G0-G1期細(xì)胞百分比明顯下降。抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果與過表達(dá)相反。另外，過表達(dá)和抑制14-3-3γ基因的結(jié)果顯示，14-3-3γ正調(diào)節(jié)Cyclin D1的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明14-3-3γ正向調(diào)節(jié)mTOR和Stat5a的磷酸化水平從而促進(jìn)乳蛋白合成和細(xì)胞增殖。
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)14-3-3γ相互作用蛋白進(jìn)行了鑒定，共鑒定出44種蛋白質(zhì)與14-3-3γ相互作用，分為8類:與轉(zhuǎn)錄、翻譯、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、

9、細(xì)胞骨架和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白以及酶類。蛋白質(zhì)翻譯對(duì)于乳蛋白合成至關(guān)重要，因此在翻譯相關(guān)蛋白中選擇了eIF1AX、RPS7和eIF5這3個(gè)蛋白作為研究對(duì)象，驗(yàn)證它們與14-3-3γ蛋白是否真的存在相互作用。實(shí)驗(yàn)利用western blotting、免疫熒光共定位和熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)對(duì)eIF1AX、RPS7和eIF5與14-3-3γ之間是否存在直接的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)eIF1AX、RPS7和eIF5這3個(gè)蛋白與14-3-3γ蛋白是特

10、異性結(jié)合的，3個(gè)蛋白與14-3-3γ蛋白共定位指數(shù)均在90％以上，3個(gè)蛋白與14-3-3γ蛋白的FRET效率均在20％-35％，顯著高于對(duì)照組(＜5％)。這表明eIF1AX、RPS7和eIF5這3個(gè)蛋白與14-3-3γ蛋白均存在直接的相互作用，14-3-3γ蛋白調(diào)節(jié)泌乳的功能很可能與這3個(gè)互作蛋白有關(guān)。
　　本研究進(jìn)一步檢測(cè)了蛋氨酸對(duì)eIF1AX、RPS7和eIF5表達(dá)的影響。結(jié)果表明，添加蛋氨酸后，細(xì)胞中eIF1AX、RPS7、

11、eIF5和β-酪蛋白的表達(dá)量均顯著升高，這說明eIF1AX、RPS7和eIF5這3個(gè)蛋白可能與乳蛋白合成有關(guān)。
　　本實(shí)驗(yàn)又檢測(cè)了14-3-3γ過表達(dá)和抑制對(duì)eIF1AX、RPS7和eIF5表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)14-3-3γ基因后，細(xì)胞中eIF1AX、RPS7和eIF5的表達(dá)量均顯著增加，而抑制14-3-3γ基因后，細(xì)胞中eIF1AX、RPS7和eIF5的表達(dá)量均顯著降低。此外，14-3-3γ基因過表達(dá)可顯著提高eIF2α