奶牛乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)及應用.pdf

1、本研究通過對奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)方法的篩選,培養(yǎng)出生理功能正常的奶牛乳腺上皮細胞,以該細胞為模型,研究棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸對奶牛乳腺上皮細胞生長、胞液脂質(zhì)小滴的形成、脂肪酸合成及其相關酶基因表達的影響. 從荷斯坦奶牛乳房無菌采取乳腺組織,通過不同的方法分離、培養(yǎng)、純化奶牛乳腺上皮細胞,研究奶牛乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)效果.結(jié)果表明:組織塊接種、0.25﹪的胰酶和100u/mI,透明質(zhì)酸酶的混合液37℃消化組織塊3h,可以

2、得到大量細胞用于原代培養(yǎng).在以DMEM為基礎培養(yǎng)液,在培養(yǎng)液中添加10﹪的胎牛血清、100ug/mI,的雙抗、表皮生長因子(10ng/mI.)、胰島素(0.5ug/mI.)、氫化可的松(1u咖L)、孕酮(1u咖L)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(5ug/m!.入谷氨酰胺(0.3m咖L)等,組成的完全培養(yǎng)液中奶牛乳腺上皮細胞生長良好.顯微結(jié)構(gòu)顯示:奶牛乳腺上皮細胞在體外培養(yǎng)過程中含有不同的細胞類型,大多數(shù)上皮細胞呈多角形,細胞之間連接成片,細胞界限明顯,部分

3、細胞界限不明顯. 用Western.blotting檢測奶牛乳腺上皮細胞分泌的B.酪蛋白,以鑒定該細胞的生理功能是否正常;通過染色體的數(shù)目及核型分析以鑒定體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)化.結(jié)果顯示:培養(yǎng)液中含有B.酪蛋白,說明該乳腺上皮細胞生理狀況良好;染色體數(shù)目正常,染色體數(shù)目為60,核型與哺乳動物染色體圖譜一致,說明該細胞系在體外培養(yǎng)條件下未發(fā)生轉(zhuǎn)化. 在奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)液中添加游離脂肪酸,包括棕櫚酸、硬脂

4、酸、油酸、亞油酸,研究外源脂肪酸對乳腺上皮細胞生長、胞液中脂質(zhì)小滴的形成、細胞脂肪酸合成以及脂肪酸合成關鍵酶ACC、FAS、FAT/CD36和SCDmRNA表達量的影響.結(jié)果顯示,棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸對細胞的生長都有抑制作用,抑制作用隨著脂肪酸的添加量和不飽和程度的增加而增加;油酸、亞油酸對胞液中脂質(zhì)小滴的合成有促進作用,而棕櫚酸、硬脂酸沒有這種作用;棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸都能抑制細胞內(nèi)脂肪酸的從頭合成;棕櫚酸、硬脂酸、油