奶牛乳腺上皮細胞葡萄糖攝取的調(diào)控及其對乳成分合成的影響研究.pdf

1、葡萄糖是乳汁合成的主要前體物質(zhì)之一，與乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)密切相關。本研究圍繞奶牛乳腺上皮細胞葡萄糖攝取的調(diào)控及其對乳成分合成的影響展開了以下研究：首先建立了泌乳奶牛乳腺上皮細胞模型；其次分別研究了泌乳相關激素和單糖基質(zhì)對葡萄糖轉運載體基因表達和葡萄糖攝取的影響；最后探討了葡萄糖供應量對主要乳成分(乳脂和乳糖)合成的影響及其可能機制。主要研究結果如下：
　　 1.泌乳奶牛乳腺上皮細胞模型建立及其功能檢測
　　 該部分旨在建立奶

2、牛乳腺上皮細胞泌乳模型。試驗選擇DMEM/F-12培養(yǎng)液，用組織塊培養(yǎng)法得到奶牛乳腺上皮細胞。為維持乳腺細胞的泌乳功能，在培養(yǎng)體系中添加了催乳素、胰島素、氫化可的松、轉鐵蛋白等成分。根據(jù)乳腺上皮細胞和成纖維細胞對胰酶敏感度的不同，采用0.25％胰酶和0.15％胰酶加0.02％EDTA反復酶差消化，得到較為純化的乳腺上皮樣細胞。培養(yǎng)細胞呈單層、鵝卵石樣鋪展，可形成腺泡和島嶼狀結構，具有上皮細胞的典型形態(tài)特征。此外，通過乳腺上皮細胞特征性細

3、胞角蛋白18免疫細胞化學鑒定和細胞生長曲線分析，證明培養(yǎng)得到的細胞是正常乳腺上皮細胞。研究發(fā)現(xiàn)細胞傳至第10代，細胞依然生長旺盛。通過細胞亞顯微結構觀察、乳脂形態(tài)觀察、αs1酪蛋白基因表達、酪蛋白Western-blot含量檢測等方法檢測乳腺細胞的泌乳功能，證明培養(yǎng)至第10代的乳腺上皮細胞仍具有乳汁合成和分泌功能，表明本研究建立的奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)模型可作為乳腺生理相關功能研究的模型。
　　 2.泌乳相關激素對乳腺細胞主要葡萄

4、糖轉運載體基因表達的影響及相關信號通路研究
　　 該部分研究了泌乳相關激素(催乳素、胰島素和氫化可的松)單獨及組合作用對GLUT1和GLUT8基因表達的影響，探討了胰島素調(diào)控GLUT8基因表達和葡萄糖攝取的相關信號通路。結果發(fā)現(xiàn)，不同濃度催乳素和胰島素對GLUT1基因表達均無顯著影響(P>0.05)，高劑量催乳素可顯著降低GLUT8基因表達(P<0.05)；添加胰島素可促進GLUT8基因表達(P<0.05)；隨著氫化可的松濃度增

5、加，GLUT1和GLUT8基因表達均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。同時添加胰島素(5ng/mL)和氫化可的松，發(fā)現(xiàn)胰島素和氫化可的松有明顯的交互作用(P<0.01)，氫化可的松可拮抗胰島素提高GLUT8基因表達的作用；同時添加3種激素時，GLUT1和GLUT8基因表達與單獨添加氫化可的松趨勢一致。
　　 其次，利用胰島素相關信號通路PI3K、MAPK和PKC的抑制劑和激動劑，研究了胰島素調(diào)控GLUT8基因表達和葡萄糖攝取的分子機理。研

6、究發(fā)現(xiàn)。抑制MAPK對乳腺細胞葡萄糖攝取無顯著影響(P>0.05)，抑制PI3K可顯著降低胰島素促進的葡萄糖攝取和GLUT8基因表達(P<0.05)，提示胰島素可能主要通過PI3K通路參與調(diào)控葡萄糖攝??；進一步研究PI3K的下游信號分子PKC發(fā)現(xiàn)，激活PKC可顯著提高GLUT1、GLUT8基因表達和乳腺細胞葡萄糖攝取(P<0.05)，抑制PKC可顯著降低PKC激活所促進的GLUT1、GLUT8基因表達和葡萄糖攝取(P<0.05)。上述研

7、究結果提示，GLUT1和GLUT8基因表達分別受不同泌乳相關激素的調(diào)控，胰島素可能主要通過PI3K/PKC通路促進GLUT8表達和葡萄糖攝取。
　　 3.單糖基質(zhì)和葡萄糖濃度對乳腺細胞糖攝取的調(diào)控及其機理研究
　　 該部分研究了不同類型單糖基質(zhì)(葡萄糖或果糖)對乳腺細胞的影響以及葡萄糖濃度調(diào)控乳腺葡萄糖攝取的分子機制。首先，研究了葡萄糖或果糖對乳腺細胞生長、糖攝取和轉運的影響。研究發(fā)現(xiàn)，添加葡萄糖或果糖組乳腺細胞活力均高

8、于無糖組(P<0.05)；糖濃度相同時，果糖組的細胞活力顯著高于葡萄糖組(P<0.05)；隨著葡萄糖或果糖濃度的增加，乳腺細胞活力均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而糖攝取量顯著升高(P<0.05)。上述研究結果提示，奶牛乳腺上皮細胞可以利用果糖，其轉運和利用效率可能高于葡萄糖。
　　 其次，研究葡萄糖濃度對葡萄糖轉運載體和己糖激酶的影響。結果發(fā)現(xiàn)，處理12 h時，與對照組(2.5 mmol/L)相比，5或10 mmol/L葡萄糖不影響

9、GLUT1 mRNA豐度(P>0.05)，而20 mmol/L葡萄糖可顯著降低GLUT1基因表達(P<0.05)，高濃度葡萄糖組(5、10和20 mmol/L)的己糖激酶酶活均高于對照組(P<0.05)，而不同葡萄糖濃度對GLUT8和HK2的mRNA豐度均無顯著影響(P>0.05)；處理24時，GLUT1、GLUT8和HK2基因表達均隨著葡萄糖濃度的增加而降低(P<0.05)；添加HK2抑制劑三-溴丙酮酸(3-BrPA)可顯著降低2.5

10、和10 mmol/L葡萄糖組的葡萄糖攝取和細胞活力(P<0.05)。研究結果提示，葡萄糖濃度可能部分通過提高HKs酶活調(diào)控乳腺細胞葡萄糖攝取，而HK2在此過程中起重要作用。
　　 4.葡萄糖濃度對乳腺細胞主要乳成分合成和葡萄糖代謝的影響
　　 該部分研究了葡萄糖供應對奶牛乳腺細胞主要乳成分合成和葡萄糖代謝的影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度葡萄糖(5、10或20 mmol/L)可影響乳脂合成關鍵酶的基因表達，處理12時，與5 mm

11、ol/L葡萄糖組相比，增加葡萄糖濃度對乙酰CoA羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、二酰甘油酰基轉移酶(DGAT)和三磷酸甘油?；D移酶(GPAT)的基因表達量均無顯著影響(P>005)；處理24和48 h時，ACC、FAS、DGAT和GPAT的基因表達量隨葡萄糖濃度的增加而降低(P<005)，但均高于相同葡萄糖濃度處理12 h組。其次，研究當葡萄糖供應充足時(處理12 h)葡萄糖濃度對乳脂含量的影響，結果發(fā)現(xiàn)，乳腺細胞甘油三酯含

12、量隨葡萄糖濃度的增加而增加，其中10和20 mmol/L組顯著高于2.5mmol/L組(P<005)。
　　 不同濃度葡萄糖處理12 h對乳糖合成、糖酵解和磷酸戊糖途徑的影響。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組(2.5 mmol/L)相比，高濃度葡萄糖(5和10 mmol/L)可顯著提高β-1，4-半乳糖基轉移酶(B4GALT)的基因表達量(P<005)；不同濃度葡萄糖不影響乳清蛋白(LA)基因表達量(P>005)；10和20 mmol/L葡萄

13、糖可顯著提高乳糖合成酶蛋白含量(P<005)；10 mmol/L組丙酮酸激酶和葡萄糖6磷酸脫氫酶活力均顯著高于2.5 mmol/L組；高濃度葡萄糖組(10 mmol/L)的線粒體勢能和細胞ATP含量均高于低濃度葡萄糖組(2.5 mmol/L)(P<005)。上述研究結果提示，增加葡萄糖供應可能增加了乳糖合成底物濃度，促進乳糖合成，促進葡萄糖酵解和磷酸戊糖途徑的代謝，增加細胞能量產(chǎn)出，進而提高乳腺乳脂合成量。
　　 綜上所述，本研