利用免疫金標(biāo)記技術(shù)研究野生型及重組TMV CP的混合包裝模型.pdf

1、TMVCP由158個氨基酸殘基組成，其中第153～158位是本實(shí)驗(yàn)室常用的外源肽段替代區(qū)域。在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作當(dāng)中，在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作當(dāng)中，采用外源肽展示系統(tǒng)的策略構(gòu)建了一株重組病毒TMV-S6-1，并利用該病毒在煙草中成功地表達(dá)了一段外源多肽——S6-1(SARS病毒表面蛋白上的一段長為12個氨基酸的肽段)。 為了比較野生型TMV的外殼蛋白wtCP與TMV-S6-1的融合外殼蛋白CPS6-1的包裝能力及粒子的感染能力，我們

2、將從體內(nèi)與體外兩個方面進(jìn)行研究：將重組病毒TMV-S6-1與野生型TMV混合感染Nicotianatabacumcv.Samsunnn煙草上；與此同時，將重組病毒TMV-S6-1與野生型TMV各自的CP按比例與TMV的RNA混合，進(jìn)行體外包裝。 混合TMV粒子共感染煙草后，我們發(fā)現(xiàn)重組病毒TMV-S6-1雖然被組裝，但是卻不再具備系統(tǒng)感染的能力。分析其原因，我們認(rèn)為這可能是由于病毒之間排外機(jī)制的作用，使得單獨(dú)感染敏感型煙草時可以

3、正常遠(yuǎn)距離傳播的TMV-S6-1在與wtTMV共感染時喪失了系統(tǒng)感染的能力。 使用免疫金標(biāo)記電鏡技術(shù)觀察TMV粒子在體內(nèi)與體外的包裝狀況，免疫金標(biāo)記所使用的第一抗體分別為anti-CP153～158、anti-S6-1。這兩種抗體由家兔抗血清——anti-wtCP和anti-CPS6-1經(jīng)交叉吸附實(shí)驗(yàn)，屏蔽掉抗血清中煙草蛋白的抗原決定簇及CP152上游的抗原決定簇得來，檢驗(yàn)結(jié)果顯示它們的特異性較高，效價都為1：2500。

4、 免疫金標(biāo)記電鏡觀察實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，體外包裝得到的混合病毒粒子溶液中wtTMV與TMV-S6-1占了總數(shù)的94％左右，它們所占的比例接近1：1，不同于體內(nèi)系統(tǒng)的是它還存在約6％由兩種CP共同包裝得到的粒子。這說明融合了外源肽S6-1的外殼蛋白CP亞基構(gòu)向的變化，對其裝配TMV病毒粒子所產(chǎn)生的影響不是很大，它仍具有正常的組裝能力，且由絕大多數(shù)粒子為單一CP體外包裝而來的現(xiàn)象可知，包裝時外殼蛋白之間的聚集及其組裝成粒子的過程具有高度的選擇性