應(yīng)用基因標(biāo)記技術(shù)探討混合造血干細(xì)胞移植后過(guò)繼免疫治療療效的研究.pdf

1、異體造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)因具有移植物抗白血病(GVL)效應(yīng)，移植后復(fù)發(fā)率低；但移植物抗宿主病(GVHD)及感染等并發(fā)癥發(fā)生率高，致使移植相關(guān)死亡率高，且由于存在HLA配型相合問(wèn)題，大部分患者無(wú)行異體造血干細(xì)胞移植治療的可能，致使臨床應(yīng)用受限。 白體造血干細(xì)胞移植(auto-HSCT)開(kāi)展己近40年。它雖不受配型限制，并發(fā)癥較輕，但因缺乏GVL效應(yīng)而復(fù)發(fā)率較高。復(fù)發(fā)是自體造血干細(xì)胞移植失敗的重要原因，減少?gòu)?fù)發(fā)成為提

2、高療效的關(guān)鍵。 我們以往的研究證明，以自體為主，混合HLA半相合異體造血干細(xì)胞的干細(xì)胞移植(混合造血干細(xì)胞移植，mixed-HSCT)可在一定程度上兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)，克服其不足，誘導(dǎo)形成混合嵌合體，減輕GvHD，同時(shí)保留GVL效應(yīng)。 鑒于此，本課題從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)入手，應(yīng)用含有標(biāo)記基因的K562細(xì)胞和BALB/C小鼠制備白血病小鼠模型；應(yīng)用基因標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討以自體為主，混合H-2半相合異體造血干細(xì)胞的干細(xì)胞移植(即混

3、合造血干細(xì)胞移植)及移植后應(yīng)用供體淋巴細(xì)胞輸注聯(lián)合IL-2治療急性髓性白血病的療效和嵌合體形成情況，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)；并應(yīng)用于臨床實(shí)踐，觀察該方法對(duì)成人急性髓性白血病的治療效果。 1.研究?jī)?nèi)容及方法： (1)K562細(xì)胞株的基因轉(zhuǎn)移：培養(yǎng)PA317-GCGPXSN和NIH3T3及K562細(xì)胞株；應(yīng)用PA317-GCGPXSN細(xì)胞株制備病毒上清，NIH3T3細(xì)胞株測(cè)定病毒滴度；應(yīng)用rhIL-3、rhIL-6及rhSCF刺

4、激K562細(xì)胞株后，實(shí)施基因轉(zhuǎn)移；應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定基因轉(zhuǎn)移效率及PCR方法測(cè)定NeoR基因，將完成基因轉(zhuǎn)移的K562細(xì)胞株命名為K562+細(xì)胞株。 (2)BALB/C小鼠模型制備：SPF級(jí)BALB/C小鼠按實(shí)驗(yàn)分組后分別經(jīng)直線加速器照射2GY和3GY，24小時(shí)后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562+細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組以尾靜脈一次性注射K562+細(xì)胞。觀察小鼠的一般情況及生存時(shí)間、骨髓細(xì)胞分類(lèi)及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類(lèi)、細(xì)胞亞群及相關(guān)臟器病理檢查、

5、流式細(xì)胞儀測(cè)定K562+細(xì)胞、PCR方法測(cè)定組織浸潤(rùn)情況。 (3)常規(guī)方法培養(yǎng)BALB/CxC57BLF1代小鼠骨髓細(xì)胞，并應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定T亞群及NK細(xì)胞，CD34+細(xì)胞。在經(jīng)過(guò)PHA，rhIL-2，rhIL-3、rhIL-6及rhSCF刺激后實(shí)施基因轉(zhuǎn)移，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定基因轉(zhuǎn)移效率，PCR方法測(cè)定NeoR基因。將完成基因轉(zhuǎn)移的F1代細(xì)胞命名為F1+細(xì)胞。 (4)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：用上述方法制備白血病小鼠模型，按實(shí)驗(yàn)分組

6、。7天后做6Gy照射，照射后24小時(shí)做自體骨髓移植或混合骨髓移植，混合移植間隔1小時(shí)?；旌弦浦步M每7天輸F1代細(xì)胞一次，應(yīng)用IL-2者隔同腹腔注射一次。觀察4周后殺死存活小鼠，做外周血及骨髓細(xì)胞形態(tài)檢查，細(xì)胞亞群測(cè)定，GFP+細(xì)胞測(cè)定，NeoR基因測(cè)定，肝臟、脾臟病理學(xué)檢查及組織勻漿細(xì)胞的GFP+細(xì)胞和NeoR基因的測(cè)定。 (5)13例急性髓性白血病患者在完全緩解期實(shí)施了Mixed-HSCT，于造血恢復(fù)后，給予DLI聯(lián)合IL-2

7、治療2-7次：另有11例急性髓性白血病患者在同樣條件下實(shí)施Mixed-HSCT，移植后未予特殊治療。 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果： (1)K562細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移效率K562-細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度數(shù)值為0.56％，K562+細(xì)胞熒光強(qiáng)度為77.16％。兩者差異顯著(P＜0.01)。PCR方法擴(kuò)增到了NeoR基因的特異性片斷，說(shuō)明含GFP和NeoR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒已轉(zhuǎn)移并整合進(jìn)入K562細(xì)胞的基因組中。 (2)白

8、血病模型制備情況 ①照射對(duì)小鼠免疫功能的影響E組小鼠經(jīng)2Gy照射后外周血CD3、CD4、CD8、CD16+CD56+細(xì)胞呈進(jìn)行性降低，至第3周開(kāi)始出現(xiàn)逐漸恢復(fù)跡象，4周后恢復(fù)正常。F組在3GY照射后CD3、CD4、CD8、CD16+CD56+細(xì)胞呈進(jìn)行性降低，至第4周開(kāi)始出現(xiàn)逐漸恢復(fù)跡象，5周后恢復(fù)正常。在同一時(shí)間，3GY照射較2GY照射所導(dǎo)致的細(xì)胞亞群降低的程度更為明顯(P＜0.05)。脾、胸腺在照射后外觀較正常小鼠縮小，重量

9、減輕并延續(xù)至4周才基本恢復(fù)至照射前的水平，肝臟重量無(wú)明顯變化。 ②發(fā)病情況照射2、3GY后未接種K562+細(xì)胞的BALB/C小鼠(E、F組)觀察4周未出現(xiàn)自然死亡。照射2、3GY后分別接種K562+細(xì)胞2×106、5×106的BALB/C小鼠(A、B、C、D組)在接種5-7天時(shí)發(fā)病。A組于30天內(nèi)全部死亡；C組于24天內(nèi)全部死亡；B組于23天內(nèi)全部死亡；D組于17天內(nèi)全部死亡；各組小鼠生存天數(shù)有顯著性差異，均顯著短于正常對(duì)照組(

10、P＜0.01)。體重均較正常對(duì)照組顯著下降(P＜0.01)。小鼠的白血病發(fā)病率為100％，無(wú)自發(fā)緩解。隨著接種白血病細(xì)胞數(shù)量的增加和照射劑量的增加，小鼠的存活時(shí)間逐漸縮短，且外周血及骨髓中人原、早幼粒白血病細(xì)胞所占比例逐漸增加。病理學(xué)檢查證實(shí)有腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果與此相一致，PCR方法也證實(shí)了NeoR基因的存在。 (3)F1代細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移效率F1(-)細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定的熒光強(qiáng)度數(shù)值為0.63％，F(xiàn)1(+)細(xì)胞熒

11、光強(qiáng)度為76.04％。兩者差異顯著(P＜0.001)。PCR方法擴(kuò)增到了NeoR基因的特異性片斷，說(shuō)明含GFP和NeoR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒已轉(zhuǎn)移并整合進(jìn)入F1(+)細(xì)胞的基因組中。 (4)小鼠骨髓移植實(shí)驗(yàn) ①骨髓移植細(xì)胞數(shù)目測(cè)定實(shí)驗(yàn)組小鼠移植白體骨髓細(xì)胞中，CD34+細(xì)胞為1.32％，CD3+細(xì)胞26.56％,CD4+細(xì)胞13.44％，CD8+細(xì)胞3.09％，CD16+CD56+細(xì)胞7.53％。移植異體骨髓細(xì)胞(F

12、1+)中，CD34+細(xì)胞為1.51％，CD3+細(xì)胞61.41％，CD4+細(xì)胞39.57％，CD8+細(xì)胞27.61％，CD16+CD56+細(xì)胞9.59％；移植異體骨髓細(xì)胞(F1-)中，CD34+細(xì)胞為1.49％，CD3+細(xì)胞65.86％，CD4+細(xì)胞40.13％，CD8+細(xì)胞19.16％，CD16+CD56+細(xì)胞9.70％；其中F1(+)與F1(-)細(xì)胞各亞群之間沒(méi)有明顯差別(P＞0.05)，即每只實(shí)驗(yàn)鼠所移植的各類(lèi)細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有明顯差別。

13、 ②各實(shí)驗(yàn)組療效觀察白血病小鼠模型組(A組)在20天內(nèi)全部死亡，白血病小鼠模型經(jīng)6GY照射后(F組)在14天內(nèi)全部死亡，在瀕死小鼠骨髓及外周血中均檢測(cè)到GFP及NeoR基因。A組瀕死小鼠外周血及骨髓見(jiàn)11％-64％不等的原、幼稚細(xì)胞。F組瀕死小鼠外周血及骨髓細(xì)胞稀少，主要為淋巴細(xì)胞。A組和F組瀕死小鼠骨髓及外周血中均檢測(cè)到GFP及Neo基因的存在。兩組瀕死小鼠外周血T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞均極低。其它實(shí)驗(yàn)組小鼠均有6-3只不等的小鼠

14、存活時(shí)間＞28天，存活的小鼠外周血及骨髓細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)同正常小鼠，外周血T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞已恢復(fù)至正常范圍，各組之間無(wú)明顯差別(P＞0.05)。在存活小鼠中輸注F1(+)細(xì)胞者檢測(cè)到了GFP及Neo基因。存活小鼠肝、脾檢查未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在肝、脾組織中的浸潤(rùn)及充血等現(xiàn)象。組織勻漿細(xì)胞的GFP和NeoR基因的測(cè)定中未檢測(cè)到GFP+細(xì)胞，亦未擴(kuò)增到特異性的Neo基因片段的存在。證明K562+的腫瘤細(xì)胞在存活小鼠的肝、脾中消失。 (5

15、)臨床療效觀察混合造血干細(xì)胞移植患者均獲得造血重建。無(wú)GVHD發(fā)生。觀察組中有3例M2a患者在接受1、2、2次DLI+IL-2治療后+3、+4、+7月復(fù)發(fā)死亡。1例M2a患者接受2次DLI+IL-2治療后，于+1年時(shí)出現(xiàn)MDS，死于腦出血。1例M5患者應(yīng)用DLI+IL-2治療1次后出現(xiàn)不明原因高熱、抽搐，死于癲癇持續(xù)狀態(tài)。其余8例患者隨訪1-5年均無(wú)病存活。其中1例M4、1例M5患者有嵌合體形成。長(zhǎng)期生存率為61.5％(8/13例)。對(duì)

16、照組有2例M2a，2例M4，1例M5于移植后+1-+7月復(fù)發(fā)死亡，1例M3患者于+25天死于腦出血。其余2例M3，2例M4，1例M5隨訪3-5年均無(wú)病存活。其中后3例均有嵌合體形成。長(zhǎng)期生存率為45.4％(5/11例)。 3.結(jié)論： (1)含有GFP基因和NeoR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒成功地轉(zhuǎn)移進(jìn)入K562細(xì)胞株和BALB/C×C57BLF1代小鼠骨髓細(xì)胞中。 (2)BALB/C小鼠經(jīng)照射后從尾靜脈注射K562細(xì)胞株可