膠體金標(biāo)記技術(shù)

1、膠體金標(biāo)記技術(shù)膠體金標(biāo)記技術(shù)膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物或顯色劑，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。由于它不存在內(nèi)源酶干擾及放射性同位素污染等問題，且利用不同顆粒大小的膠體金還可以作雙重甚至多重標(biāo)記，使定位更加精確。因此已成為繼熒光素、酶、同位素及乳膠標(biāo)記技術(shù)之后的一種新型標(biāo)記技術(shù)。現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于電鏡、流式細(xì)胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷試劑的制造等領(lǐng)域。用膠體金作為特殊標(biāo)記物的研究始于60年代初，1962年Fel

2、dberr等報(bào)道了用膠體金標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行電子顯微鏡的研究。1971年，Tayl又將膠體金引入電鏡免疫標(biāo)記技術(shù)中。近年來的研究表明，膠體金也可作為體外免疫加層試驗(yàn)的指示物。由于膠體金作為標(biāo)記物具有很多優(yōu)點(diǎn)，因此自其問世以來，在國內(nèi)外的許多研究領(lǐng)域中得到了迅速的發(fā)展。近年來，它更多的被應(yīng)用于免疫學(xué)和細(xì)胞學(xué)相關(guān)分子水平的檢測(cè)中。尤其隨著人們物質(zhì)生活的改善，有關(guān)人類健康的問題在現(xiàn)實(shí)生活中已顯得非常突出。從90年代至今的多篇報(bào)道都是關(guān)于動(dòng)物體或人體

3、相關(guān)抗體和病原體檢測(cè)的。制備方法制備方法在溶液中金顆粒呈圓形，邊緣平整，界線十分清楚。金顆粒表面帶有大量負(fù)電荷，由于靜電的排斥力，使其在水中保持穩(wěn)定狀態(tài)，形成穩(wěn)定的膠體，所以稱其為膠體金。膠體金的制作方法有白磷還原法，抗壞血酸還原法，檸檬酸三鈉還原法和鞣酸—檸檬酸三鈉還原法。通過改變反應(yīng)體系中氯金酸與還原劑的比例（即增加或減少還原劑的量）可得到所需不同直徑的金顆粒。但前兩種方法制備得到的金顆粒直徑大小不均一，所以目前常用后兩種方法，以檸

4、檬酸三鈉還原法為例，有兩種方法。1Frens標(biāo)準(zhǔn)方法：1)取0.01%HAuCl4溶液50mL加熱煮沸，隨即快速加入1%檸檬酸三鈉溶液0.5mL。2)約過25s沸騰的溶液變?yōu)榈{(lán)色，大約再過70s，藍(lán)色突然轉(zhuǎn)變?yōu)榱良t色，3)繼續(xù)煮沸約5分鐘后結(jié)束反應(yīng)。4)冷卻后用0.1MK2CO3溶液調(diào)至所需PH值。5)此后再延長反應(yīng)時(shí)間或另加入額外的檸檬酸三鈉都不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該法制備得到的金顆粒直徑約為41nm，如前所述要想得到更大或更小的金顆粒，

5、該方法依然可行，唯一不同的是需要改變加入還原劑的量。另外，采用此標(biāo)準(zhǔn)方法所需反應(yīng)時(shí)間最短。2Slot標(biāo)準(zhǔn)方法：1)取1mL1%HAuCl4溶液溶于100mL水中，2)再加入2mL1%二水檸檬酸鈉溶液。3)將該混合溶液加熱煮沸約15~30min，直至溶液顏色變?yōu)榱良t色，4)冷卻后，用0.1MK2CO3溶液調(diào)整PH值，該法制備的金顆粒直徑約為15nm。膠體金標(biāo)記蛋白的原理是：在堿性條件下，膠體金顆粒表面帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)所帶正電荷基團(tuán)之間

6、產(chǎn)生靜電吸引而牢固結(jié)合，這種結(jié)合對(duì)所標(biāo)記蛋白的生物學(xué)活性無明顯影響。膠體金免疫技術(shù)可大致分為液相膠體金標(biāo)記技術(shù)和固相膠體金標(biāo)記技術(shù)，其分類依據(jù)同酶免疫技術(shù)。最早的液相膠體金標(biāo)記技術(shù)叫免疫金染色法（IGS），它僅以膠體金作為標(biāo)記物和顯色劑。最初的免疫金染色都采用單標(biāo)記。即采用大小均一的金顆粒進(jìn)行標(biāo)記。后來發(fā)展到可利用不同顆粒大小的膠體金作雙重標(biāo)記甚至多重標(biāo)記。但該方法均僅以膠體金顯色，需要較高濃度的標(biāo)記物，耗費(fèi)抗體或抗原的量較多，而且需要

7、較大直徑的金顆粒（4050nm），才能獲得較高的靈敏度，而且當(dāng)金顆粒過大時(shí)，標(biāo)記物不穩(wěn)定，長期貯存容易發(fā)生自動(dòng)聚集。為克服以上缺點(diǎn)，免疫金銀染色法（IGSS）應(yīng)運(yùn)而生。該方法的原理是，先用膠體金標(biāo)記物作免疫金染色，再加入含銀的物理顯影液，則銀離子靠電荷吸引，大量吸附于金顆粒周圍，使顯色結(jié)果呈現(xiàn)金屬銀的藍(lán)灰色，同時(shí)將顯色信號(hào)進(jìn)一步放大。應(yīng)用時(shí)，由于本法最終顯色是靠金屬銀的吸附沉積，因此不需要高濃度的膠體金標(biāo)記物，將膠體金標(biāo)記物稀釋幾十倍，

8、仍可獲得同免疫金染色一樣的最佳效果。這樣不僅可以節(jié)省大量的抗體或抗（1）取1%HAuCl4水溶液1ml置燒杯內(nèi)，用1.4ml0.2molLK2CO3及25ml雙蒸水；（2）混勻，置冰浴中，攪拌下加入1ml0.7%抗壞血酸水溶液，溶液呈紫紅色；（3）隨后加蒸餾水至100ml，加熱至溶液變?yōu)榧t色為止。（4）此法制備的膠體金顆粒直徑為813nm。（三）枸櫞酸三鈉還原法【試劑及材料】（1）HAuCl4水溶液（2）1%枸櫞酸三鈉水溶液（3）0.2

9、molLK2CO3【操作方法一】（1）取0.01%HAuCl4水溶液100ml置于燒杯內(nèi)；（2）加入3ml1%枸櫞酸三鈉水溶液，加熱煮沸30min，冷卻至4℃，溶液呈紅色；（3）此法制備的膠體金顆粒直徑為10nm，大小均一?！静僮鞣椒ǘ浚?）取0.01%HAuCl4水溶液100ml置于燒杯內(nèi)；（2）加入2ml1%枸櫞酸三鈉水溶液，加熱煮沸1530min，直至溶液呈紅色；（3）冷卻后，加入0.5ml0.2molLK2CO3混勻。（4）此

10、法制備的膠體金顆粒直徑為15nm，大小均一?！静僮鞣椒ǘ浚?）取0.01%HAuCl4水溶液100ml置于燒杯內(nèi)，加熱煮沸；（2）根據(jù)需要加入2.5ml、1ml或0.75ml1%枸櫞酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱煮沸5min，直至溶液呈橙紅色；（3）此法制備的膠體金顆粒直徑分別為1820nm、30nm或50nm，大小均一。【注意事項(xiàng)】（1）玻璃器皿必須嚴(yán)格清洗，絕對(duì)潔凈后干烤。最好經(jīng)過硅化處理，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定玻璃器皿表面后，再用雙