黑楊DNA甲基轉移酶基因的分離與表達分析.pdf

1、多倍化是植物進化的重要途徑也是促進植物發(fā)生改變的重要力量。經研究表明三倍體黑楊與二倍體黑楊相比具有生長速度快的特點，實驗室前期研究證明黑楊三倍化后，其基因組甲基化水平顯著高于二倍體，說明DNA甲基化后對植物的生長發(fā)育起著非常重要的作用。DNA甲基轉移酶是DNA甲基化過程中重要的催化酶，為進一步探索三倍體黑楊速生形成的分子機制，本研究以三倍體和二倍體黑楊為材料，利用同源序列克隆、定量PCR技術、MSAP甲基化分析技術，分離了DNA甲基轉移

2、酶基因的特異片段，并對其在2x和3x黑楊之間表達差異進行了分析，試圖從DNA甲基轉移酶基因差異表達角度探究2x與3x速生性狀差異表達的原因。主要結果如下：
　　 1．利用同源序列克隆技術，首次分離出三倍體黑楊中4類(MET、CMT、DRM、DNMT2)8個特異甲基轉移酶片段，經Blast比對，其中5個片段與二倍體同源性達到100％，3個片段發(fā)生了剪切變化。
　　 2．通過實時定量PCR技術檢測8個甲基轉移酶在不同倍性、不

3、同部位、不同生長時期間表達模式的差異。通過對5個不同部位基因表達的檢測，表明不同倍性黑楊在相同的部位可能不同種類的甲基轉移酶參與主要的甲基化調控。通過分析植株從分化早期的莖尖到分化晚期的葉和莖整個生長過程中基因表達情況，發(fā)現隨著時間的推移，MET家族(PnD1和PnD2)基因可能是拮抗調節(jié)，CMT（PnD3和PnD4）家族基因可能是協(xié)同調節(jié)。而隸屬于DNMT2家族的PnD6基因在各部位的表達都比較弱，唯獨三倍體莖尖有很高的表達。由于莖尖

4、是生長旺盛的部位，PnD6有可能是影響三倍體速生的重要基因。同時還發(fā)現PnD4和PnD6兩個基因在不同倍性之間表達有明顯的差異。
　　 3．使用電子克隆、cDNA walking和RACE擴增技術相結合的策略，首次在三倍體黑楊中分離了CMT類和DNMT2類DNA甲基轉移酶基因全序列，并對其基因組結構及蛋白三維結構進行了預測。發(fā)現這兩個基因不但具有甲基轉移酶保守的核心催化區(qū)域，同時還各自具有所屬家族的特征功能區(qū)，尤其是PnD4，其

5、三維結構預測表明，該基因轉錄的蛋白可能具有一個特異的用于和染色體集合的“鉗子”結構。
　　 4．綜合表達分析的結果和cDNA全序列預測分析，我們推測，三倍體PnD4基因CD結構域的消除并沒有影響該基因在不同倍性間的表達，CMT家族的不同基因會在黑楊不同生長時期主要負責調控甲基化。隸屬于DNMT2家族的PnD6可能在分化旺盛的莖尖時期大量表達，用于后期植株的分化生長。
　　 5．利用5氮雜胞苷對水培環(huán)境下的三倍體黑楊進行脅