奶牛持續(xù)性感染口蹄疫病毒的分子生物學(xué)檢測.pdf

1、　　本實驗應(yīng)用分子生物學(xué)原理，建立一種RT-PCR方法，用于奶牛持續(xù)性感染FMDV的檢測，并對毒株的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因進行序列分析，這是我國首次在分子水平上對奶牛持續(xù)性感染FMDV問題進行研究，為國內(nèi)FMDV的檢測及分子流行病學(xué)調(diào)查打下了基礎(chǔ)?！　「鶕?jù)已發(fā)表的口蹄疫病毒(FMDV)基因序列，自行設(shè)計了一對引物，擴增口蹄疫病毒3D后1/3區(qū)段，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)，從細胞毒中擴增出大小為489bp的基因片段。經(jīng)克隆

2、及DNA序列分析表明所擴增片段為FMDV基因。該方法在靈敏度方面，可檢測出0.01個TCID50的病毒含量，同時該方法還有較好的特異性，不與豬的其它疾病如PRV、PRRSV、JEV等發(fā)生交叉反應(yīng)。陽性樣品的檢測結(jié)果與反向間接血凝(IHA)檢測結(jié)果的符合率為100％，證明該方法靈敏、特異、簡單可靠?！　?yīng)用所建立的RT-PCR方法，對采自3個奶牛場的55份鮮奶樣品及40份牛鼻試子樣品進行檢測。結(jié)果在部分鮮奶樣品及鼻試子樣品中可擴增到長度

3、約為489bp大小的條帶?？寺『螅?jīng)酶切鑒定及DNA序列分析，表明擴增片段為FMDV，與病豬水泡皮分離毒株的同源性高達90.2％。此結(jié)果表明，所建立的RT-PCR方法可用于奶牛隱性感染FMDV的檢測。　　結(jié)構(gòu)蛋白VP1是誘導(dǎo)中和抗體的主要成份，在分子流行病學(xué)調(diào)查中，趨向于分析VP1基因的核苷酸序列差異作為建立遺傳變異系譜樹。另設(shè)計一對引物，擴增FMDV主要結(jié)構(gòu)蛋白基因VP1。擴增片段長838bp，含完整的VP1基因。應(yīng)用這對引物擴增R