單克隆抗體的制備實驗

1、單克隆抗體制備實驗,Caspar Gu,2019-4-12,目錄,實驗?zāi)康?實驗原理,實驗材料,實驗步驟,注意事項,一、實驗?zāi)康?了解并掌握單克隆抗體的制備原理； 熟悉單克隆抗體的制備過程；熟練掌握無菌操作技術(shù)。,二、實驗原理,三、實驗材料,超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。,剪刀、鑷子、解剖板、平皿（直徑為10cm），15ml/50ml一次性

2、離心管，50ml玻璃融合管200目不銹鋼細胞篩，玻璃注射器針芯，10ml玻璃注射器（9號針頭）,融合前一周復(fù)蘇，第二天換液，長滿后傳代，融合前一天換液。一次融合需2~3瓶（75m2）Sp2/0細胞。,四、實驗步驟(1),1. 取飼養(yǎng)細胞取一只SPF級6-8周齡ICR小鼠，斷頸處死，置75%乙醇中消毒5min↓取一只10ml玻璃注射器，吸入7~8ml含10%FBS、HAT的RPMI1640培養(yǎng)基，剪開皮膚、沿切口上下撕開皮膚，充分暴

3、露腹部，換鑷子，拎起腹膜，沿腹部中線偏左下方進針，針頭不要進入內(nèi)臟器官，取一個干凈的酒精棉球輕輕擠壓小鼠腹部，同時反復(fù)吹打注射器，反復(fù)3-5次，待培養(yǎng)基變黃后將其轉(zhuǎn)移到80mlHAT培養(yǎng)基中，備用。,2. 取免疫小鼠脾臟免疫小鼠摘眼球取血后斷頸處死，置75%乙醇中消毒5min↓將高壓過的細胞曬放到平皿中，細胞曬中加入10ml左右的無血清1640，小鼠左側(cè)臥位，剪開皮膚，沿切口上下撕開皮膚，可以看到脾臟所在位置；換剪刀、鑷子，剪開腹

4、膜，充分暴露脾臟；換剪刀、鑷子，鑷子輕輕夾住脾臟，用剪刀分離脾臟，盡量不要帶結(jié)締組織，將脾臟放入鋼網(wǎng)中，用無菌的針頭戳幾下，用玻璃針芯輕輕擠壓脾臟直至僅剩包膜，用幾毫升無血清1640沖洗針芯和細胞曬，將濾液置于50ml離心管中，備用。,3. 收集Sp2/0細胞  取已長滿的Sp2/0細胞2~3瓶，用彎頭尖吸管將細胞吹下來，置于50ml離心管中，原瓶補液繼續(xù)培養(yǎng)↓4. 清洗脾細胞和Sp2/0 細胞 800rpm

5、，離心5min↓棄上清，輕輕磕幾下50ml離心管底部（使細胞團塊松散），加入兩吸管無血清1640，輕輕吹打均勻，補培養(yǎng)液至20ml↓脾細胞和Sp2/0 細胞，800rpm，離心5min↓5. 融合         將PEG1500置于37℃水浴鍋上，熔化后，加入0.5ml無血清1640，混勻，即為50%PEG↓取離心好的脾細胞和Sp2/0細胞，棄上清（注意保持

6、這個姿勢）用濾紙條輕輕沾去管壁上的培養(yǎng)液（保證PEG不被稀釋）。將離心管放到37℃水浴中（用一小燒杯制備水浴），1min加入PEG（邊加邊攪），攪30sec；靜止1min。,四、實驗步驟(2),四、實驗步驟(3),6. 終止    將一吸管無血清培養(yǎng)液在1min內(nèi)加入細胞中，動作盡量輕柔，邊加邊攪。（此時，細胞在PEG作用下已變形皺縮，加液太快，動作過粗，會引起細胞破裂死亡。）隨后，不用計時，但仍要慢慢滴加培養(yǎng)液，

7、最后補液至20ml?！?00rpm，離心5min↓7. 鋪板   棄上清，細胞團塊溶于100ml HAT培養(yǎng)液（前面已經(jīng)準(zhǔn)備好的）內(nèi)，充分混勻后，鋪板5-7塊。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱,第二天檢查是否污染，第五天計算融合率，第七天換液（一定要沿孔壁把原孔液體吸干凈），第十天檢測。,五 . 注意事項,1 .無菌操作：單克隆抗體的制備過程需要嚴(yán)格無菌，包括使用的器械、試劑等均需要無菌處理， 注意實驗操作中的