磺胺嘧啶單克隆抗體的制備.pdf

1、目前磺胺藥殘留的檢測方法主要是高效液相色譜法,較為簡便,結果準確,再現(xiàn)性好.但處理樣品方法涉及繁瑣、操作步驟冗長,需耗費大量溶劑,費用高,限制了該方法的廣泛使用.免疫分析是以抗原、抗體的特異性結合反應為基礎的分析技術,具有常規(guī)理化分析技術無可比擬的選擇性和很高的靈敏度,非常適用于復雜基質中痕量組分的分析.而且免疫分析方法還具有簡便、快速的特點.單克隆抗體是利用細胞融合技術,使骨髓瘤細胞和免疫動物淋巴細胞融合而成的雜交瘤細胞單克隆所產生的

2、一種特異性高度專一和化學性高度純一的抗體.與多克隆抗體相比,它是只針對一個抗原決定基產生的抗體,其結構相同,成分均一,特異性強,生物活性高,與其它抗原沒有或極少交叉反應等明顯的優(yōu)點.該實驗擬作出磺胺嘧啶的單克隆抗體,為建立磺胺嘧啶的免疫學檢測方法提供關鍵的材料.磺胺嘧啶的分子量為250,為半抗原.磺胺嘧啶分子結構中具有芳香氨基,可進行重氮化反應與載體蛋白連接.該實驗選用牛血清白蛋白(BSA)作為連接的載體.同時進行磺胺嘧啶與卵清蛋白(0

3、VA)的偶聯(lián),產物用于對照和檢測.用重氮化法將磺胺嘧啶偶聯(lián)到載體牛血清白蛋白和卵清蛋白上,成為完全抗原BSA-SD和OVA-SD.純化后進行檢測,確認磺胺嘧啶已經連接到蛋白質上.以BSA-SD免疫Balb/c小鼠,用間接ELISA方法檢測抗體效價.當效價達到1:10000以上時,可進行細胞融合.融合用的骨髓瘤細胞,必須為非分泌免疫球蛋白缺陷型的細胞,且最后與制備脾細胞的小鼠為同一品系.該實驗選用SP<,2>/0-Ag14(簡稱SP<,2

4、>)型號的骨髓瘤細胞,并使其處于生長旺盛的狀態(tài).細胞融合前必須進行飼養(yǎng)細胞的制備.選用與骨髓瘤細胞同系的小鼠腹腔巨噬細胞和淋巴細胞.飼養(yǎng)細胞一方面可提供雜交瘤細胞生長所需的群體環(huán)境,另一方面可吞噬死亡的細胞和細胞碎片,還可以分泌各種生長因子,促進雜交瘤細胞的增殖.制備通常在融合前一天進行.可供選擇的細胞融合的方法有物理法如電融合、激光融合、化學法和生物融合法.該實驗采用化學法,融合劑為分子量為1000的聚乙二醇(PEG-1000).融合

5、的過程是在50ml滅菌離心管中進行.按一定的比例將脾細胞和骨髓瘤細胞置于離心管內,使之充分接觸,按嚴格的劑量逐滴加入融合劑使細胞發(fā)生融合.然后加入合適的培養(yǎng)基,滴加到鋪滿飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)板內培養(yǎng).第二天檢查是否污染.一般在第6天左右,可見小克隆.當細胞長滿培養(yǎng)板時,取細胞上清液,用間接ELISA進行陽性孔的篩選.對篩選為陽性的細胞,進行擴大培養(yǎng).陽性細胞長滿培養(yǎng)板時,采用有限稀釋法進行亞克隆.經過兩到三次亞克隆后,將得到的陽性細胞注入小鼠