18020.洋甘菊f(shuō)ps基因的克隆表達(dá)及鹽脅迫研究

1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特另tlDH以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：壘主至!至笙簽字日期：≯c綽己月歲Et學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有

2、關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文件，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，收錄到《中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文，向社會(huì)公眾提供信息服務(wù)。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū))。學(xué)位論文作者簽名：皇恥簽字日期：枷12年‘月r日學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：速盟工作單位：盎毖延疃業(yè)盤(pán)墼電話：

3、!皇三蘭竺竺皇生2笪3通信地址：照例吐聳企鯉醒墨u&茲以步編：—羔■翌三塹————一㈣燁捅要洋甘菊(MatricariachamomillaL)又稱母菊，為菊科母菊屬一年生草本，含有揮發(fā)性芳香油，具有抑菌、消炎、解痙鎮(zhèn)靜、止痛及改善肺癌病人癥狀等作用，是一種極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的芳香植物和藥用植物。洋甘菊揮發(fā)油的主要成分為倍半萜類物質(zhì)，其生物合成途徑屬于類異戊二烯代謝途徑，而法呢基焦磷酸合酶(FPS)是這個(gè)途徑的限速酶之一。本文克隆了洋甘菊FP

4、S基因，構(gòu)建了FPS基因的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，為通過(guò)基因工程有效調(diào)控母菊莫等倍半萜類物質(zhì)的生物合成奠定基礎(chǔ)。另本文對(duì)洋甘菊鹽脅迫后種子萌發(fā)特征，生理指標(biāo)及顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，為洋甘菊的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：1克隆了洋甘菊FPS基因，并構(gòu)建克隆載體進(jìn)行測(cè)序及生物信息學(xué)分析。根據(jù)洋甘菊法呢基焦磷酸合酶mRNA全長(zhǎng)序列(AccessionNo：EF6757581)，用軟件Primer

5、Premier5設(shè)計(jì)引物，以洋甘菊花。憩RNA為模板，通過(guò)RTPCR法獲得約1000bp大小的片段，并將其連接在pMD19T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)序并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明：FPS基因全長(zhǎng)為1098bo，開(kāi)放閱讀框含有1032bp，編碼343個(gè)氨基酸殘基，與其它菊科植物的FPS基因進(jìn)行同源性比較，對(duì)其疏水性，蛋白跨膜及信號(hào)肽分析表明洋甘菊FPS為非跨膜蛋白。2構(gòu)建了原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并優(yōu)化了目的蛋白表達(dá)條

6、件。將得到的洋甘菊FPS基因亞克隆到原核表達(dá)載體pET30a()，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a()FPS，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，經(jīng)SDSPAGE檢測(cè)得到F1的蛋白分子量約為38KDa，并對(duì)日的蛋白進(jìn)行Westernblotting檢測(cè)。對(duì)目的蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，表明目的蛋白最佳誘導(dǎo)時(shí)問(wèn)為6小時(shí)。3壩0定了不同鹽(Nacl)濃度脅迫下種子的萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)、根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)及生物量的變化，同時(shí)研究了葉綠

7、素含量，可溶性糖，過(guò)氧化物酶，脯氨酸的變化，并用石蠟切片法觀察了鹽脅迫前后洋甘菊根，莖，葉等的顯微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：隨著鹽濃度的升高，洋甘菊種子萌發(fā)率，發(fā)芽勢(shì)等萌發(fā)特征指標(biāo)均呈下降趨勢(shì)，相對(duì)鹽害率增加，且隨著鹽濃度的升高，葉綠素含量先升高后降低，可溶性總糖、脯氨酸、過(guò)氧化物酶含量隨鹽濃度的升高呈上升趨勢(shì)。鹽脅迫前后洋甘菊外部形態(tài)發(fā)生明顯變化，顯微結(jié)構(gòu)中葉肉細(xì)胞層數(shù)明顯增加，鹽脅迫前后的莖和根氣隙增多，這些變化是對(duì)鹽環(huán)境的一種適應(yīng)。關(guān)