鹽脅迫下發(fā)菜多糖代謝相關(guān)差異表達(dá)基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、發(fā)菜，學(xué)名發(fā)狀念珠藻(Nostoc flagelliforme)，是一種具有較高食用及藥用價(jià)值的光能自養(yǎng)型藍(lán)藻。在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，發(fā)菜細(xì)胞向胞外分泌大量的發(fā)菜多糖，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)其亦具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤以及提高免疫等生物活性，有一定的藥用價(jià)值。
　　在鹽脅迫條件下，發(fā)菜多糖分泌量增加。前期對(duì)鹽脅迫及正常培養(yǎng)條件下的發(fā)菜樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，挖掘參與發(fā)菜響應(yīng)高鹽脅迫的相關(guān)基因。本課題在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的基礎(chǔ)上

2、，篩選出部分可能參與鹽脅迫下發(fā)菜多糖代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因，以發(fā)菜基因組為模板，對(duì)其進(jìn)行克隆與表達(dá)，分析差異表達(dá)基因的基本特征，豐富發(fā)菜的基因數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步研究發(fā)菜多糖的代謝調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　對(duì)發(fā)菜中的三個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因(GT1、GT2、GT3)、GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因(GMD)、多糖輸出蛋白基因(PEP)進(jìn)行克隆，得到基因序列，分別對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果如下：
　　GT1、GT2、GT3、GMD、

3、PEP基因序列大小分別為1290bp、1173bp、948bp、1080bp、1467bp，核酸序列分析均具有較高的保守性。GT1、GT2、GT3、GMD、PEP蛋白分子量大小分別為47.54kDa、43.16kDa、35.99kDa、41.08kDa、51.28kDa，理論等電點(diǎn)分別為9.33、7.64、6.34、5.73、5.50。GT1、GT2、GT3、GMD、PEP均為親水性蛋白，不具有跨膜活性。GT1、GT2、GT3的二級(jí)結(jié)構(gòu)

4、主要為隨機(jī)卷曲和α螺旋，GMD和PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)為隨機(jī)卷曲、α螺旋和折疊。
　　將GT1、GT2、GT3、GMD、PEP進(jìn)行擴(kuò)增，與載體pET28a連接，IPTG誘導(dǎo)其在大腸桿菌BL21中表達(dá)，分別以IPTG濃度、加入IPTG時(shí)菌液OD值、培養(yǎng)溫度為變量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，SDS-PAGE蛋白電泳比較目的蛋白的表達(dá)效果，確定目的蛋白表達(dá)的適宜條件。結(jié)果表明，蛋白表達(dá)的條件為：IPTG終濃度為1mM，加入IPTG時(shí)菌液OD值為0.8，加